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小材大用?看磁珠如何显著提高新冠中和抗体筛选效率

2020-06-05 14:15

面对来势汹汹的新冠肺炎疫情,我国通过检测与隔离相结合的方式有效控制了疫情的快速传播,为全社会在最短时间内复产复工创造了必备条件。除了阻断疫情扩散,我国的科研单位和生物企业也在加速推进疫苗和治疗药物的研发进度,希望能够尽快研发出新冠疫苗和药物,为全人类提供预防和治疗新冠肺炎的有效手段。


疫苗的研发周期较长,乐观估计还需要1年时间才能开发成功,而中和性抗体的研发周期短、特异性高、副作用小、能够量产,可用于预防和治疗新冠肺炎,因此开发高中和活性的新冠抗体是当前科研和工业界的关注热点。


2020年5月18日,北京大学谢晓亮团队及其合作伙伴在顶级期刊《细胞》上发表研究论文《Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients' B cells》[1], 报道了从新冠肺炎康复病人血清中分离出具有高中和活性的抗体,可用于预防及治疗新冠肺炎。文章的内容总结如下:


1. 利用高通量单细胞测序方法对12位新冠肺炎康复患者的血清中记忆B细胞进行RNA和VDJ测序,通过数据分析找到有大量抗体表达的IgG1克隆亚型。将其中130种单克隆抗体进行表达纯化后,发现只有两种IgG1抗体能够与 RBD结合,且其中只有一种IgG1有较弱的中和活性,说明这一轮的中和抗体筛选并不成功。


2. 为了筛选出更多能与RBD结合的抗体,研究人员将生物素化的RBD和S蛋白偶联到磁珠上,然后用偶联抗原蛋白的磁珠去富集60位新冠肺炎康复患者血清中的记忆B细胞,共分离出8558株IgG1克隆亚型,并从中筛选出169株候选抗体用于后续研究(图1)。在ELISA和SPR的实验中,发现有149株抗体能够结合SARS-CoV-2 S蛋白,而其中只有70株抗体能够结合SARS-CoV-2 RBD。

图1. 利用偶联SARS-CoV-2抗原的磁珠富集筛选记忆B细胞


3. 将169株抗体进行假病毒中和实验,发现只有与RBD结合的抗体显示出中和活性,且与RBD的亲和力接近或大于ACE2/RBD的抗体,其中和活性较强。最终挑选出7株IC50值低于0.05ug/mL的单克隆抗体用于真病毒实验,其中命名为BD-368-2的单克隆抗体的中和活性最强,其IC50值为15ng/mL (图2)。

图2. SARS-CoV-2抗体的假病毒和真病毒中和活性检测


4. 在ACE2转基因小鼠中,BD-368-2可作为治疗性药物降低感染SARS-CoV-2的小鼠体内病毒载量,还可作为预防性药物使小鼠在感染SARS-CoV-2后其生理状况保持稳定(图3)。


图3. BD-368-2抗体可作为SARS-CoV-2的预防及治疗性药物


5. 解析S蛋白与BD23-Fab复合物的3.8埃冷冻电镜结构。在S蛋白三聚体中,一个RBD呈现up构象,另两个RBD呈现down构象,BD23-Fab只与三个RBD中一个呈现down构象的RBD结合。此外,BD23-Fab与RBD的结合位点与ACE2/RBD的结合位点重合,说明BD23-Fab与ACE2竞争结合RBD是其具有中和活性的分子机理(图4)。

图4. SARS-CoV-2 S 三聚体与BD23-Fab形成复合物的空间三维结构


6. 将分离出的8558株IgG1克隆亚型的CDR3H进行结构,并将预测结构与SARS-CoV-2的中和抗体BD-23及SARS-CoV的两株中和抗体m396, 80R的结构进行比对,发现12株IgG1抗体的结构与m396和80R类似。在这12株抗体中,有7株与RBD有强结合且对SARS-CoV-2假病毒有强中和作用,说明基于比对CDR3H预测结构及已解析的病毒抗体结构可提高中和抗体的鉴定筛选效率。


在这项研究中,将偶联新冠抗原蛋白的磁珠应用于记忆B细胞的筛选能够大幅提升中和抗体的分离效率,保证候选抗体库中有足量的能够结合RBD的抗体进行后续高中和活性筛选。小小的磁珠在这项重要研究成果中发挥了大大的作用,是这项研究的画龙点睛之笔,文章通讯作者谢晓亮教授也在采访中表示:“一开始筛出的抗体只有1%符合要求。为了提高效率,我们改变思路,用磁珠聚集等办法来筛选高活性的中和抗体,成功将效率提升到20%,后通过优化最终将筛选效率提高到90%。”[2]


为了更有效节约筛选时间,加速高中和活性的新冠抗体开发,ACROBiosystems开发了高质量的S1蛋白和RBD蛋白预偶联磁珠,偶联到磁珠上的抗原蛋白都经过了严格的质控,可以最大化捕获到目标抗体或蛋白。具有即开即用、低非特异性结合的特点,能够显著提高新冠中和抗体筛选效率。




ACRO磁珠产品信息

>>>1)磁珠结合样品量

静态吸附实验表明,RBD蛋白偶联磁珠可以很好地捕获anti-SARS-CoV-2 S1抗体,磁珠载量大于40μg/mg 磁珠。


图5 RBD-Beads结合抗体量曲线


>>>2) S1蛋白和RBD蛋白偶联磁珠与抗体和ACE2蛋白的结合曲线


磁珠偶联抗原蛋白后,进行严格地质检,其中S1蛋白和RBD蛋白偶联的磁珠和抗体以及ACE2的结合性能检测过程:每个管子取0.1 mg Beads (1mg/mL, 100 μL),  洗涤3次后,去上清,加入100 μL对应浓度的抗体或ACE2蛋白 (10μg/mL~0.039μg/mL), 反应1小时后,再加荧光标记二抗反应1小时,检测对应的Binding信号。

图6 S1偶联磁珠和Anti-SARS-CoV-2 S1抗体的结合曲线


图7  S1偶联磁珠和ACE2蛋白的结合曲线


图8  RBD偶联磁珠和Anti-SARS-CoV-2 S1抗体的结合曲线


图9  RBD偶联磁珠和ACE2蛋白的结合曲线


综上所述,磁珠不仅可以用来捕获目标抗体,用于抗体的质谱分析鉴定,还可以用于细胞克隆的筛选,快速筛选出目标克隆,如上述文章中,用偶联抗原蛋白(S和RBD蛋白)的磁珠去富集新冠肺炎康复患者血清中的记忆B细胞,分离出阳性IgG1克隆亚型,并从中筛选出高中和活性的抗体株。此外,偶联抗原的磁珠也可用于表面展示抗体的噬菌体或酵母细胞筛选。


不论是用来做Immunocapture还是Biopanning, 磁珠和偶联抗原的质量都至关重要,ACROBiosystems致力于开发更好更优的产品,以节约药物开发成本和周期。




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分子 货号 产品描述 种属 订购/预购
S1 protein MBS-K001 SARS-CoV-2 Spike S1 protein-coupled magnetic beads SARS-CoV-2

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S protein RBD MBS-K002 SARS-CoV-2 Spike protein RBD-coupled magnetic beads SARS-Cov-2

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CD3 MBS-K003 CD3 epsilon&CD3 delta Heterodimer protein-coupled magnetic beads Human

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BCMA MBS-K004 BCMA-coupled magnetic beads Human

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CD19 MBS-K005 CD19-coupled magnetic beads Human

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HER2 MBS-K006 HER2-coupled magnetic beads Human

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PSMA MBP-K007 PSMA-coupled magnetic beads Human

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CD33 MBC-K008 CD33-coupled magnetic beads Human

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ROR1 MBR-K009 ROR1-coupled magnetic beads Human

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CD38 MBC-K010 CD38-coupled magnetic beads Human

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EpCAM MBE-K011 EpCAM-coupled magnetic beads Human

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原文链接:

1.https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420306206/pdf?md5=bc50c48c4f9e845e107d6c4a575ba4fa&pid=1-s2.0-S0092867420306206-main.pdf

2.https://finance.sina.com.cn/wm/2020-05-21/doc-iirczymk2863827.shtml?cre=tianyi&mod=pcpager_focus&loc=1&r=9&rfunc=61&tj=none&tr=9

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