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三聚体S蛋白:比你想象的更强大

2020-09-22 14:00    浏览量:400


你知道的三聚体S蛋白:新冠病毒研究的重要靶标



新冠病毒包含S蛋白 (spike protein),N蛋白(nucleocapsid protein),E 蛋白(envelope protein)和M 蛋白(membrane protein)四种结构蛋白。其中S蛋白负责病毒识别宿主细胞受体并介导病毒与宿主细胞膜的融合,是病毒打开宿主细胞“大门”的“钥匙”,也是病毒感染后引起宿主免疫系统产生中和性抗体的主要靶标,因此相较于其它三种结构蛋白,S蛋白在新冠疫苗开发以及中和性抗体筛选中备受关注。


新冠S蛋白包含S1和S2两个功能性亚基,其中S1亚基负责与宿主细胞受体ACE2结合,S2亚基负责将S蛋白锚定在宿主细胞膜上并介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。S1亚基包括N-Terminal Domain (NTD) 和 Receptor Binding Domain (RBD),其中RBD参与结合宿主细胞受体ACE2;S2亚基包括 Heptad Repeat(HR),Central Helix(CH)和Connector Domain(CD),此外在S1亚基和S2亚基交界处有一个Furin酶切位点(图1)1

图1. S蛋白的序列示意图



S蛋白在病毒表面以同源三聚体形式存在,当S1亚基中的RBD与宿主细胞ACE2结合后,引发三聚体不稳定性的发生,进而造成S1亚基和S2亚基发生解离,S2亚基的构象变为高度稳定的融合后结构,因此S蛋白具有融合前(Prefusion)和融合后(Postfusion)两种构象(图2)2。研究人员发现, S蛋白的构象形式很不稳定,即使不与宿主细胞受体ACE2结合,也会自发出现由Prefusion到Postfusion的构象改变,这对疫苗开发和中和性抗体筛选带来巨大的挑战。

图2. S蛋白的结构变化示意图




你不知道的三聚体S蛋白:正确的三聚体结构是关键

正因为S蛋白的重要功能及构象易变的特性,获得三聚体形式、性质稳定、构象均一的S蛋白成为成功开发疫苗、中和性抗体以及血清学检测试剂盒的关键因素。经过基于蛋白结构分析以及大量的实验尝试,科研人员发现当把S2亚基的2个氨基酸突变为脯氨酸后(S-2P),S蛋白的构象将变得更稳定,绝大部分的S蛋白都处于Prefusion的三聚体构象状态。接下来我们就来总结下更稳定的S蛋白在科学研究、疫苗研发、中和抗体筛选以及血清学检测试剂盒开发中发挥的作用。




 比你想象的更强大:Hold住新冠研究的全场景


应用场景一:科学研究

解析S蛋白的空间三维结构对理解S蛋白介导受体识别及膜融合过程至关重要,但S蛋白构象的天然不稳定性使解析其结构变得极其困难。当采用S-2P突变来稳定S蛋白的结构后,研究人员能够得到构象均一的处于Prefusion状态的三聚体蛋白样本,并利用冷冻电镜的方法成功解析出新冠S蛋白的高分辨率结构,为分析S蛋白发挥生物学功能的机理提供分子理论基础(图3)1

图3. 新冠S蛋白的冷冻电镜结构


应用场景二:疫苗开发

苗通过模拟天然病毒的免疫原,有效激发人体免疫系统产生针对天然病毒的中和性抗体,进而保护人体免受感染。目前全球有300多种新冠疫苗处于研发进程的不同阶段,除病毒灭活疫苗外,大部分疫苗(病毒载体疫苗、基因重组蛋白疫苗、核酸疫苗)均选用S蛋白作为免疫原。如果疫苗产生的S蛋白处于Prefusion状态,将促使人体免疫系统产生针对Prefusion构象的中和性抗体,在天然病毒真正来袭时这些中和性抗体将把S蛋白锁定在无法入侵细胞的形式,起到保护人体的作用。


对临床试验进度领先的非病毒灭活疫苗进行整理后,我们发现美国的Moderna以及辉瑞开发的mRNA疫苗,强生的腺病毒载体疫苗和Novavax的基因重组蛋白疫苗均采用了S-2P的突变形式,说明国际疫苗公司非常重视Prefusion状态S蛋白在疫苗有效性上的潜力(图4)。

图4. 靶向S蛋白的疫苗开发


应用场景三:血清学试剂盒开发

美国NIH的研究团队在开发新冠抗体诊断试剂盒时也利用了S-2P形式,并联合使用SDS-PAGE,SEC-MALS和负染电镜三种方法来验证重组S蛋白以三聚体形式存在于溶液中,以确保试剂盒中使用的S蛋白具有天然生理活性(图5)3

图5. 三聚体S蛋白的生化分析


在进行新冠疫苗免疫原性评价时,通常会利用ELISA方法检测免疫后的血清样本中针对S蛋白特异性抗体的滴度。多家疫苗公司均在ELSIA平板中包被S-2P蛋白,以检测针对Prefusion状态的抗体滴度(图6)4

图6. 三聚体S蛋白在抗体滴度检测中的应用


应用场景四:中和性抗体筛选

目前进入临床研究阶段的大部分中和性抗体均是利用RBD作为诱饵筛选出来,但利用S蛋白作为诱饵还可筛选出针对其他表位,如针对NTD,S2亚基的中和性抗体,这些抗体与针对RBD的抗体进行联用,可更有效的阻断病毒入侵宿主细胞。军事医院科学院的陈薇院士研究团队就是利用S-2P蛋白成功筛选出针对NTD表位的高中和活性抗体,经研究显示此抗体与针对RBD的抗体联用,具有更好的中和效果(图7)5

图7. 新冠S蛋白与NTD抗体的冷冻电镜结构




新发现:更稳定的三聚体S蛋白


在不断探索和持续攻关下,近期科研人员发现在S-2P的基础上,再将S2亚基的4个氨基酸突变为脯氨酸(S-6P),可更好地稳定S蛋白的Prefusion状态,且S蛋白的稳定性显著增强,显示出比S-2P更好的效果,在上述四个应用场景中的使用潜力巨大(图8)6


图8. S-6P蛋白的稳定性及负染电镜研究


ACROBiosystems根据文献报道,通过特殊设计开发出以正确三聚体形式存在的高活性新冠S蛋白,是目前市场上唯一使用SEC-MALS技术和负染电镜技术对蛋白的分子量和聚体形式进行验证的三聚体S蛋白产品。结果显示,三聚体S蛋白在溶液生理条件下以正确的三聚体形式存在,且三聚体含量达到90%以上,同时,经ELISA验证S蛋白可与ACE2蛋白和新冠病毒抗体很好地结合,说明此蛋白具有非常理想的天然活性。




验证数据

三聚体S蛋白的纯度、分子量和聚体形式经SDS-PAGE、SEC-MALS和负染电镜技术验证。

Fig 1. The purity of SARS-CoV-2 S protein, His Tag, Super stable trimer (MALS & NS-EM verified) (Cat. No. SPN-C52H9) was more than 90% verified by SDS-PAGE under reducing (R) condition. The molecular weight was around 550-660 kDa confirmed by SEC-MALS. The particles are similar in size and appearance to SARS-CoV-2 trimers reported in published literature verified by negative stain electron micrography.

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ELISA验证,三聚体S蛋白与ACE2蛋白结合活性强

Fig 2.  Immobilized Human ACE2, Fc Tag (Cat. No. AC2-H5257) at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 S protein, His Tag, Super stable trimer (MALS & NS-EM verified) (Cat. No. SPN-C52H9) with a linear range of 0.5-16 ng/mL.

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ELISA验证,三聚体S蛋白与新冠病毒抗体结合活性强

Fig 3. Immobilized Anti-SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody, Human IgG1 (Cat. No. SAD-S35) at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 S protein (R683A, R685A), His Tag, Super stable trimer (Cat. No. SPN-C52H9) with a linear range of 0.5-16 ng/mL.

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参考文献:

1. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation

2. Tectonic conformational changes of a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion

3. Standardization of enzyme-linked immunosorbent assays for serosurveys of the SARS-CoV-2 pandemic using clinical and at-home blood sampling

4. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 — Preliminary Report

5. A neutralizing human antibody binds to the N-terminal domain of the Spike protein of SARS-CoV-2

6. Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes

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