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RBD蛋白突变与中和抗体的较量

2020-10-26 16:03    浏览量:242

截至2020年10月16日,世卫组织报告已确诊的COVID-19病例3700万例,累计死亡超100万例[1]。为尽快得到新冠病毒的有效防治手段,各国科研单位正夜以继日开发各种抗病毒药物和治疗方案。

在疫苗研发方面,最近阿斯利康疫苗AZD1222在临床三期临床实验暂时HOLD;美国的强生集团宣布因旗下正在研发的新冠疫苗,在第三阶段人体试验时发生安全隐患,宣布终止最后阶段的临床试验。而我国启动新冠疫苗的紧急使用,在部分地区开放预约接种,这一消息无疑是振奋人心的。

与此同时,来自26个国家的234个公司或机构在开发针对新冠病毒感染的164个抗体药项目,其中54个项目已达到临床阶段。这些抗体候选药物中,已有13种直接针对新冠病毒感染的中和抗体药物进入临床实验,其中以再生元制药,礼来,葛兰素史克,阿斯利康四家进展最快。阿斯利康AZD7442开发提速,在两个月时间内已完成临床I,II期实验,进入临床III期验证(见表1)[2-4]


表1. 新冠抗体药物开发进展[2-4]


中和抗体 vs. Spike RBD

9月29日,再生元公布了REGN-COV2 的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期的临床试验结果,数据显示,REGN-COV2减少了患者的病毒载量,并减轻了非住院COVID-19患者的症状,在减少患者就医上也显示出积极的信号。

再生元制药REGN-COV2由REGN10987和REGN10933两个抗体组成的抗体鸡尾酒,这两个抗体为再生元从VelocImmune转基因小鼠技术和新冠病毒肺炎康复者血液中分离得到的全人源中和抗体。它们具备非竞争性且同时与病毒刺突蛋白的关键受体结合域(RBD)结合,屏蔽了RBD与ACE2的结合界面,并削弱了病毒因突变造成的逃逸[5]

10月初特朗普总统感染新冠后,REGN-COV2鸡尾酒被用于特朗普总统新冠治疗,特朗普总统本人宣称该疗法疗效显著;目前,已有两家药企,再生元和礼来向FDA申请由两种单克隆抗体混合而成的鸡尾酒疗法的紧急使用授权[6]

根据最新研究[7],中和抗体可以被分为四类:

1)直接阻断人类宿主的ACE2与“up”构象状态下的病毒受体结合域(RBD)的结合,打断病毒宿主膜融合,进而抑制病毒的侵染能力;
2)与“up”/“down”构象状态下的病毒受体结合域(RBD)均能结合的中和抗体,不仅可以与ACE2展开竞争,还可以利用表位联系邻近的病毒受体结合域(RBD),改变棘突蛋白三聚构象;

3)靶向非ACE2结合域的中和抗体;

4)结合新冠RBD结合域,但无中和作用的抗体。以上四类抗体中和作用失效的主要原因之一是棘突蛋白点突变。

目前正在开发的中和抗体(表1)主要靶向新冠棘突蛋白(SPIKE)的受体结合域(RBD);通过阻断人类宿主的ACE2与病毒受体结合域的结合,抑制病毒的膜融合能力。

需要注意的是,部分棘突蛋白点突变已对中和抗体产生广谱抗性:研究发现大多数在受体结合结构域(RBD)的突变体对病毒感染能力影响较小,但RBD 突变体A475V,L452R,V483A和F490L对某些中和抗体产生抗性(图1.)[8]


图1. 中和抗体对棘突蛋白变异体的抗原性分析结果:纵列为中和抗体,横排为棘突蛋白变异体;红色框表示中和活性的增加,蓝色框表示中和活性的降低。[8]


RBD突变对不同抗体中和活性影响的体外验证

基于以上研究,利用ACROBiosystems现有平台和产品,我们对上述棘突蛋白突变进行了体外验证,验证了不同抗体(AS35, AM122, AM128)对原型和不同突变型RBD蛋白中和活性。

实验数据证实RBD A475V突变型(货号:SPD-C52Hd突变对中和抗体AS35(货号:SAD-S35具备抗性:相比原型RBD(货号:SPD-C52H3),AS35对RBD A475V突变型中和活性低3倍以上,而其他RBD突变对AS35的中和活性未产生明显影响(图2)。


图2. 单克隆抗体AS35(货号:SAD-S35)对ACE2-RBD结合中和作用验证结果。

在对另外两个抗体中和活性的研究中,我们发现RBD 突变体对 AM122(货号:S1N-M122)的中和活性影响不明显,而AM128(货号:SPD-M128)对部分突变体中和活性较原型高:根据IC50结果,AM128对RBD(A475V)突变型(货号:SPD-C52Hd)和RBD (F490L)突变型(货号:SPD-C52Hf)的中和活性相比原型高2-3倍(图3&4)。


图3. 单克隆抗体AM122(货号:S1N-M122)对ACE2-RBD 结合中和作用验证结果。


图4. 单克隆抗体AM128(货号:SPD-M128)对ACE2-RBD 结合中和作用验证结果。

在进一步的亲和力验证(BLI)中发现:

1)Human ACE2(货号:AC2-H5257)与原型及不同突变S protein RBD蛋白结合,亲和力水平RBD (V483A)(货号:SPD-C52H5)较其他突变RBD (A475V) (货号:SPD-C52Hd)、 RBD (L452R) (货号:SPD-C52He)、A3966 RBD (F490L) (货号:SPD-C52Hf)和原型RBD (WT) (货号:SPD-C52H3)高;

2)抗体AM122(货号:S1N-M122)与原型及不同突变S protein RBD蛋白结合,几种突变型与原型亲和力水平相差不大;

3)抗体AM128与原型及不同突变S protein RBD蛋白结合,亲和力水平RBD (V483A)> RBD (A475V) ≈RBD (L452R) ≈ RBD (原型) >RBD (F490L);

4)抗体AS35(货号:SAD-S35)与原型及不同突变S protein RBD蛋白结合,亲和力水平RBD (V483A) ≈ RBD (A475V) > RBD (L452R) ≈RBD (WT) > RBD (F490L)。

抗体与RBD结合能力比较发现AM122亲和力较其他两个抗体AS35和AM128高(见图5),但中和效果不及AM128(见图3&图4)。另外需注意突变体RBD (A475V)(货号:SPD-C52Hd)与抗体AS35(货号:SAD-S35)呈现不稳定结合状态,BLI结果与SPR亲和力验证不一致(见图6)。


图5 不同RBD蛋白与ACE2蛋白、抗体亲和力比较(BLI)(KD: M)


图6. A:SPR:Anti-SARS-CoV-2 RBD Neutralizing Antibody, Human IgG1 (Cat. No. SAD-S35) captured on CM5 chip via Anti-human IgG Fc antibodies surface can bind SARS-CoV-2 S protein RBD (A475V), His Tag (Cat. No. SPD-C52Hd) with an affinity constant of 87.7 nM as determined in a SPR assay (Biacore 8K) (Routinely tested).

B:BLI:Loaded Anti-SARS-CoV-2 RBD Neutralizing Antibody, Human IgG1 (Cat. No. SAD-S35) on AHC Biosensor, can bind SARS-CoV-2 S protein RBD (A475V), His Tag (Cat. No. SPD-C52Hd) with an affinity constant of 6.43 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e).

根据ACROBiosystems产品活性验证结果,可以确认新冠病毒棘突蛋白突变对中和抗体活性影响可以通过体外检测方案进行验证:根据AS35、AM122与AM128中和活性与亲和力差异比较结果,体外中和活性(ELISA)验证和亲和力(BLI&SPR)验证可以应用于单抗药物对ACE2-RBD中和活性评估。

此外需要注意的是本文中使用的单克隆抗体AS35(货号:SAD-S35),AM122(货号:S1N-M122)和AM128(货号:SPD-M128)均靶向RBD, 但表位不同,作为热点抗体疗法,鸡尾酒疗法的抗体配对策略两个抗体分别靶向S蛋白的不同表位,这样病毒同时产生两种逃逸突变并对两个抗体都有耐药性概率非常低。使用两个单抗组合的另一优势是它们往往有协同效应,抗体联用产生中和作用的总剂量要比其中任何一个抗体药单独使用的剂量低。这种协同效应可以降低了抗体药的成本。

ACROBiosystems相关产品

ACROBiosystems自主开发了SARS-CoV-2 全长刺突蛋白(Spike), S蛋白亚基(S1, S2, RBD, S1 NTD, S1 CTD及相关突变蛋白)并通过ELISA、BLI、SPR等多项实验验证其生物活性与中和抗体的结合。

产品列表


抗体


重组蛋白


验证数据


货号:SPN-C52H9

产品:SARS-CoV-2 S protein, His Tag, Super stable trimer (MALS & NS-EM verified)

图7. Immobilized Anti-SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody, Human IgG1 (Cat. No. SAD-S35) at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 S protein, His Tag, Super stable trimer (Cat. No. SPN-C52H9) with a linear range of 0.3-10 ng/mL.


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货号:S1D-C52H3
产品:SARS-CoV-2 (COVID-19) S1 protein CTD, His Tag (MALS-verified)

图8. Serial dilutions of Anti-SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody were added into Biotinylated Human ACE2, His,Avitag (Cat. No. AC2-H82E6): SARS-CoV-2 S1 protein CTD, His Tag (MALS-verified) (Cat. No. S1D-C52H3) binding reactions. The half maximal inhibitory concentration (IC50) is 1.47 μg/mL.


点击申请Protocol


货号:S1D-C52H6

产品:SARS-CoV-2 (COVID-19) S1 protein NTD, His Tag

图9. Anti-SARS-CoV-2 Spike NTD Antibody, Chimeric mAb (Cat. No. SPD-M121) captured on CM5 chip via Anti-human IgG Fc antibodies surface can bind SARS-CoV-2 S1 protein NTD, His Tag (Cat. No. S1D-C52H6) with an affinity constant of 74.6 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200).


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邮件:order.cn@acrobiosystems.com
电话:13521050293
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参考资料:

1.https://www.who.int/

2.https://chineseantibody.org/covid-19-track

3.https://pipelinereview.com/index.php/2020100776116/DNA-RNA-and-Cells/Lilly-provides-comprehensive-update-on-progress-of-SARS-CoV-2-neutralizing-antibody-programs.html

4.https://pipelinereview.com/index.php/2020101076139/Antibodies/COVID-19-Long-Acting-AntiBody-LAAB-combination-AZD7442-rapidly-advances-into-Phase-III-clinical-trials.html

5.J Hansen et al.  Science (2020) DOI: 10.1126/science.abd0827

6.https://www.sohu.com/a/423188429_708296

7.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2852-1

8.https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.012



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