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新冠DNA疫苗开发新浪潮?中和抗体检测试剂盒助您一臂之力

2021-07-09 11:03    浏览量:167

新冠疫情快速蔓延,对全球公共卫生安全造成了巨大的威胁,接种安全、有效的新冠疫苗是当下人们的迫切需求。截至2021年7月,全球共有19款新冠疫苗被批准上市,种类包括灭活疫苗、mRNA疫苗、病毒载体疫苗、蛋白亚单位疫苗和减毒活疫苗。另外,有128款疫苗已进入临床实验阶段,其中有11款是DNA疫苗。

DNA疫苗具有易于设计和量产、生产成本低、性质稳定等优点,对比传统类型的疫苗存在明显优势。此外,根据新冠DNA疫苗临床试验发表的数据,DNA疫苗能够很好兼顾有效性与安全性,是未来疫苗研发新趋势,因此对新型新冠DNA疫苗的研发仍在火热进行中。

2021年5月27日,Kit Man Chai等人在《PLOS Neglected Tropical Diseases》期刊发表了文章《DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsters》,研究者通过质粒构建得到6种不同的DNA候选疫苗,并对这些候选疫苗的有效性和安全性进行了系统验证,最后通过动物实验证明了接种DNA疫苗可有效防护新冠病毒感染。这项研究的详细解读如下:



01
候选DNA疫苗的质粒构建与抗原表达


1.候选DNA疫苗的质粒构建与抗原表达

实验流程如图图1.所示。研究者首先对SARS-CoV和SARS-CoV-2各构建了一种表达全长S蛋白的质粒。此外,由于抗原表达与疫苗效力密切相关,研究者又对SARS-CoV-2设计了4种不同的Spike基因片段,共得到6种不同的候选疫苗,它们分别为:

1. pSARS-S:表达SARS-CoV全长S蛋白的质粒;

2. pSARS2-S:表达SARS-CoV-2全长S蛋白的质粒;

3. ptSARS2-S:信号肽为组织纤溶酶原激活(tPA)前导序列的SARS-CoV-2全长S蛋白表达质粒;

4. ptRBD:信号肽为tPA前导序列的SARS-CoV-2 RBD表达质粒,RBD表达片段为aa319-aa541

5. ptRBDTM:信号肽为tPA前导序列的SARS-CoV-2 RBD至跨膜区表达质粒,表达区间片段为aa319-aa1236

6. ptSdTM:信号肽为tPA前导序列的SARS-CoV-2跨膜结构域缺失的表达质粒,表达区间为aa13-aa1213

2. Spike蛋白的蛋白质印迹分析

数据显示(图2pSARS-SpSARS2-S皆可在相应的分子量处检测到全长S蛋白。ptSARS2-SptRBDTMptSdTM变体的表达水平相似,ptRBD的表达水平最高。



02
候选疫苗的筛选


3. 候选DNA疫苗的验证方法

1评估候选疫苗的有效性与长效性

实验结果显示,pSARS-S和pSARS2-S免疫动物的血清均可识别SARS-CoV-2的全长S区,S2区和RBD区,且IgG抗体滴度相近,但只有pSARS2-S可以引起高水平中和反应(图4.)

此外,为进一步验证pSARS2-S免疫效果,研究者还使用了中和抗体滴度检测试剂盒对血清样本中抗体对ACE2结合RBD的抑制能力进行了评估。结果表明 pSARS2-S免疫可以诱导竞争性抗体,有效地阻断新型冠状病毒RBD与ACE2受体的结合。

4.  接种pSARS-SpSARS2-S疫苗免疫小鼠后的抗体反应

研究者还对比了不同候选DNA疫苗的免疫原性,实验结果显示,对全长S蛋白的抗体滴度ptSARS2-S>ptRBD>ptSdTM>ptRBDTM,对RBD的抗体滴度ptRBD>ptSARS2-S>ptSdTM>ptRBDTM。这些不同的变体并没有诱导比pSARS2-S更高的中和抗体水平(图5)

图.5.  接种SARS-CoV-2不同变体疫苗免疫小鼠后的抗体反应

另外,实验结果显示在小鼠免疫20周后血清中全长S蛋白的IgG滴度无明显变化,中和抗体滴度降幅约18.6%,这意味着pSARS2-S免疫可对新冠状病毒产生了持久的体液应答


2评估疫苗的安全性

根据相关研究报道,Th2细胞反应相较于Th1的免疫反应具有更高的疫苗相关性呼吸道疾病(VAERD)的风险,这意味着偏向Th1的免疫反应所产生的副作用风险可能较低Th1细胞反应会产生炎性细胞因子(IFN-γ),而Th2细胞反应可产生细胞因子IL-5IL-13。研究者通过ELISA方法检测pSARS2-S疫苗注射后小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-5IL-13的含量,结果发现血清中检测到的子IFN-γ的含量远高于IL-5IL-13的含量,这意味着注射pSARS2-S DNA疫苗可产生偏向于Th1细胞反应

综上所述,pSARS2-S疫苗是合适的候选疫苗,可诱导体内产生特异性抗体和中和抗体,并且具有保护效力时间长、安全性好等特点。



03
pSARS2-S疫苗对SARS-CoV-2的保护效果


6.  DNA疫苗动物模型实验流程

动物模型是开发新冠疫苗的关键,可用于评估疫苗的效力。本研究使用仓鼠模型来评估候选疫苗对于新冠病毒的保护效力,其原因是仓鼠ACE2与人ACE2具有高度近似性。研究者对叙利亚仓鼠注射了pSARS2-S疫苗,经实验证明仓鼠体内产生了高水平特异性抗体和中和抗体。用活病毒进行鼻内攻击,发现在活病毒攻击三天后病毒滴度和RNA拷贝数大幅降低(图7)。以上实验结果表明接种pSARS2-S DNA疫苗可诱导对新型冠状病毒的保护性免疫

7.  活病毒攻击三天后检测仓鼠肺中的病毒RNA拷贝数和抗体滴度



04
总结


通过Kit Man Chai等人的研究,证明了新冠DNA疫苗可以有效防护新冠病毒,且拥有良好的安全性和长效性。基于上述的这些优势,新冠DNA疫苗是一类理想的疫苗平台,非常适合紧急情况下快速应对新冠肺炎疫情。接下来DNA疫苗的研究应当更深入的评估疫苗在临床实验中的有效力及安全性,包括改变疫苗注射方式以提高免疫原性,通过动物模型进一步研究老年龄群体对于病毒感染后的抵抗能力等。

在对新冠疫苗火热研发的同时,我们也要关注到新冠病毒不断地在进行新的突变及流行,对疫苗的有效性已经构成了逾加严峻的挑战,因此研究者也需要对突变株疫苗投入更多的研究。




在本研究候选疫苗有效性评估过程中,研究者采用ACROBiossystems提供的中和抗体滴度检测试剂盒(Cat.No.TAS-K022)评估血清样本中抗体对ACE2结合RBD的抑制能力,所得结果与CPE方法检测中和抗体和对SARS-CoV- 2 RBD病毒的ELISA滴度结果一致。






为助力评估疫苗对新冠病毒变异株的中和抗体滴度,ACROBiosystems经过大量的实验摸索,在开发针对Wild type毒株中和抗体检测试剂盒(Cat. No.TAS-K022)的基础上,成功开发出针对Alpha|B.1.1.7,Beta|B.1.351,Gamma|P.1突变株的中和抗体检测试剂盒,针对Delta|B.1.617.2突变株的中和抗体检测试剂盒也将于近期问世。

检测原理:
试剂盒应用竞争ELISA方法。样本中的中和抗体与微孔板上固定的Human ACE2 Protein竞争结合HRP-SARS-CoV-2 RBD/Spike,在450nm处测定样本吸光度值(OD450nm),样本OD450nm与样本中中和抗体的含量呈负相关。
产品特点:

> 操作简单,方便可靠

> 可同时检测90+样本

应用场景:
可用于新冠疫苗的效价评估,对接种疫苗后血清样本中的中和抗体进行检测等,能够显著提高疫苗评价的效率和准确度,是对现有疫苗评价方式的重要补充。










产品列表

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验证数据

经实验验证,TAS-K022具有高特异性与高灵敏度的特点,检测接种疫苗后血清中和抗体的滴度,与FDA批准的ELISA试剂盒具有高相关性(图8)。

图8. TAS-K022 与 FDA 批准的 ELISA 试剂盒的相关性分析

经实验验证,使用上述ELISA试剂盒检测接种疫苗的血清样本对Wild type和B.1.1.7变异株的中和能力接近,但对B.1.351和P.1毒株的中和能力明显下降(图9)。

图9. 新型冠状病毒中和抗体滴度检测试剂盒,包含WT-RBD(Cat. No. RAS-N022)、B.1.1.7 RBD(Cat. No. RAS-N028)、B.1.351 RBD(Cat. No. RAS-N031)、P.1 RBD(Cat. No. RAS-N034)、B.1.1.7 Spike(Cat. No. RAS-N036),B.1.351 Spike(Cat. No. RAS-N037)和P.1 Spike(Cat. No. RAS-N038),检测56份接种疫苗后的血清样本中的中和抗体,以评估疫苗对SARS-CoV-2相关变异株(VOC)的疗效。



参考文献:

1. https://covid19.trackvaccines.org/

2. https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html

3. DNA vaccination induced protective immunity against SARS CoV-2 infection in hamsterss(May 27, 2021)https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0009374

4. Delivery methods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines(June 15, 2020)https://doi.org/10.4049/jimmunol.1900517



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