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【前沿进展】突破性感染病例初现,谁才是真凶?

2021-07-20 14:54    浏览量:147

近期由于新冠病毒Delta突变株在印度、美国、英国、俄罗斯等地区快速传播,全球新冠疫情形势再次恶化,许多国家的每日新增确诊病例都创下历史新高,并且出现了“突破性感染”的病例。所谓“突破性感染”是指个体在全程接种完疫苗后仍然感染新冠肺炎的现象,即病毒突破了疫苗的防线,造成这种现象的原因之一是患者感染了部分或完全绕过疫苗保护的突变毒株。

目前,已有许多关于新冠病毒突变株的研究表明,新冠病毒Spike蛋白上出现的突变导致康复病人血清中的多克隆抗体对病毒的中和能力下降,其中在Spike RBD区域上出现的突变带来的影响尤为明显。近期,来自世界领先的研究机构Fred Hutchinson Cancer Research Center的研究组在Cell Host & Microbe发表了一篇具有高度完整性的科研报告,题为Comprehensive mapping of mutations in the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human plasma antibodies,详细分析了究竟哪些Spike RBD突变会让血清抗体的作用大打折扣,对如何对抗新冠突变株和突破性感染有重要的意义。


大多数发挥中和作用的抗体靶向Spike RBD

首先,为了证实大多数发挥中和作用的抗体是靶向Spike RBD区域的抗体,这项研究选用了在不同时间点(症状消失后15-121天)采集的来自17个康复病人的35份血清样本,用偶联RBD的磁珠捕获并去除血清中的RBD抗体。研究人员用磁珠法处理前后的血清与Spike RBD或整个Spike胞外域蛋白分别进行ELISA结合实验,从而比较RBD抗体剥离前后的血清中和能力。实验表明,用磁珠法捕获RBD抗体可以有效去除血清中的RBD抗体,同时保留靶向其它结合位点的抗体。如图1所示,在分离血清中的RBD抗体后,血清与RBD的结合急剧减少,几乎完全消失;但与Spike的结合只减少了一些,说明血清中还有其它抗体存在。这项实验也向我们展示了RBD抗体在血清中总抗占有相当的比例。

1. 磁珠法分离RBD抗体前后(pre vs. post)康复血清对RBD(上)和spike(下)的结合活性。

同时,研究组测试了这35份血清样本在RBD抗体剥离前后对Spike (D614G) 假病毒的中和活性。结果显示,在约94%的样本中,血清的大部分中和活性是由RBD抗体提供的;在超1/3的样本中,RBD抗体提供了>90%的血清中和活性(图2)。通过磁珠和假病毒的方法,RBD抗体的关键作用得到验证,因此接下来的研究也聚焦在RBD上的突变。


2. 磁珠法分离RBD抗体前后(pre vs. post35份康复血清对Spike(D614G)假病毒的中和抗体滴度(NT50)。实心球代表抗体分离前;空心球代表抗体分离后;标黄代表在后续实验中用于绘制突变逃逸图谱的血清样本。右侧的百分比数字代表血清总抗中由RBD抗体提供的中和活性。

“逃逸图谱”揭示导致中和下降的RBD突变

为全面分析所有可能导致抗体中和作用下降的RBD突变,该研究组通过deep-mutational scanning绘制出了RBD的突变图谱。该方法是通过建立一个庞大的酵母展示库,在每个酵母菌表面展示一种不同的RBD突变蛋白。整个文库包括了几乎所有可能发生的RBD单点突变。这项实验使用了康复后15-61天内收集的11份来自不同个体的血清样本。经D614G假病毒体系验证,这些选取的血清样本对RBD都有一定中和作用,其中RBD抗体为总抗提供的中和活性约为63-99%。实验将酵母展示库和康复血清一起孵育反应,然后利用荧光激活流式细胞术(FACS)分选并扩增对中和抗体作用呈现显著逃逸的RBD突变;并用deep sequencing技术测定某个特定RBD突变在新冠基因组中出现的频率。

研究组将每个RBD突变对血清中和作用的影响定义为该突变的“逃逸系数(escape fraction)”,这个系数越高,逃逸现象越明显;由此绘制出的“逃逸图谱(escape maps)”呈现出不同RBD突变的逃逸系数分布情况。研究组将逃逸系数高的RBD突变进行了分析和归类,发现它们可以被主要划分为三段突出的RBD结合位点(图3):1. Receptor-binding motifRBM)上的一段receptor-binding ridge2. 443-450 loop3. core RBD epitopeRBM上的突变包括E484及发生在E484附近的L455F456G485F486F490等。据报道,有很多中和活性强的中和抗体靶向443-450这一区间,包括Regeneron鸡尾酒疗法中的两种抗体。Core RBD位于距RBM稍远的位置,靶向这一区域的抗体普遍活性不强,和SARS存在交叉。

图3. 重要RBD突变位点区间划分

逃逸图谱显示,E484F456这两个位点呈现出最为显著的免疫逃逸:11份血清样本中,有9份对RBD-E484的结合活性显著降低;所有样本和RBD-F456的结合活性都显著降低。研究还显示,RBD上某些区域的突变对抗体结合活性没有太大影响:比如343附近的区域,已知是一种冠状病毒广谱抗体S309的靶点;再如E465附近的区域,目前不存在任何已知的中和抗体,研究者分析靶向这个位点的抗体可能很罕见,或者活性不高。

面对突变,康复者免疫防线变化如何?

为探究康复者如果二次暴露在突变病毒的风险下,免疫防线将受到怎样的影响,研究组对血清抗体活性随时间的变化做了进一步实验。他们在稍晚的时间点(康复后76-121天)再次采集了以上11个康复病人的血清,重复实验并绘制了逃逸图谱。结果显示,在超半数样本中,血清和突变RBD的结合活性无明显变化,说明血清抗体的特异性保持不变;但在少数样本中,血清随着时间过去变得更加广谱,能够结合更多突变RBD;在一例样本中,F456E484突变对血清活性的影响在初期不明显,但在后期显现出来。因为样本量较少,无法得出明确结论,但可以看出病毒突变对中和抗体免疫防线的弱化作用随个体和时间不同而变化;且有些血清型对突变有更强的抵抗力。

在大多数情况下,导致抗体结合降低的RBD突变也会降低抗体中和活性,这一点通过spike假病毒中和实验得到了验证。使中和作用产生最显著下降的突变是E48410-60倍),G44630倍),G4853-5倍)等(图4)。在某些样本中,血清中和抗体对E484K/E484Q/E484P的中和活性下降可以达到35-60倍;而10倍左右的下降即相当于去除所有血清中RBD抗体的活性损失。

4. 假病毒中和实验验证不同血清型对不同spike突变的中和作用

假病毒中和实验显示F456是个例外,该突变虽然明显降低抗体结合活性,但对中和活性几乎没有影响。研究者分析,这是因为mutational mapping是把RBD单独拿来分析,忽略了spike蛋白在真实情况下的不同构象会影响RBD上的表位展示。F456只在spike呈现"up conformation”的时候才暴露出来,然而spike在与人体细胞表面受体融合前通常呈现“down conformation”,因此在假病毒展示的spike蛋白上F456靶点是被隐藏起来的,无法与抗体结合。

上述RBD免疫逃逸位点是否在真实世界中存在?

为了确认实验筛选出突变型在真实世界中存在,研究组统计了每种突变在GISAID病毒基因序列数据库中出现的频率,并比较了这些突变的频率和免疫逃逸之间的联系(图5)。E484K突变降低血清中和作用的能力是最为突出,突变频率约为0.11%,出现在Beta, Gamma突变株上;E484Q出现在Kappa突变株上。另外两个值得关注的位点K417NN501Y对部分血清抗体存在一定逃逸,但在该项研究中逃逸效果均不明显,突变频率分别为0.07%1.39%。此外,明显影响抗体结合、但对血清中和作用影响有限的F456突变在真实世界中几乎不存在。

5. 实验筛选出的RBD免疫逃逸位点在真实世界中的突变频率

总结

总结来说,这项研究系统地分析了新冠Spike RBD突变对抗体活性的影响,得出了和中和实验结果基本一致的RBD突变逃逸图谱,发现对抗体活性产生主要影响的突变集中在几个RBD上的位点,其中最突出的是E484。对这一现象的研究可以帮助人们预测并左右新冠病毒在未来的发展趋势。例如,人体中和抗体如果只靶向病毒上的少数几个位点,一个重要的单点突变逃逸就可以严重降低中和水平,在疾病预防上也就需要迭代的疫苗来应对;而病毒中和如果是通过靶向不同位点的多克隆抗体来实现的,单点突变通常不足以对整体中和作用产生严重的影响。为避免高频率、逃逸性强的突变在新冠病毒上持续出现,多种抗体组合的方式也许是一种药物开发策略。



这项研究的关键部分使用了ACROBiosystems提供的预偶联RBD蛋白磁珠(Cat.No.MBS-K002)捕获血清中的抗体,实现了快速、彻底的RBD抗体分离。

该款产品是将生物素化的RBD蛋白偶联到具有超顺磁性的链霉亲和素 (SA) 磁珠上,利用链霉亲和素-生物素(SA-Biotin)系统的高结合亲和力(K=10^-15),实现高效率的抗体捕获和筛选,帮助研究人员简便实验过程、缩短实验周期、降低实验成本,奠定了实验成功的基础。



磁珠法自开发以来,已成为分离和纯化生物分子的优选方法,相比传统的层析法,具有方法步骤简单、可避免使样本受到破坏、无需增加其它操作工艺等优点。

除了该款产品,ACROBiosystems基于独特的生物素化标记蛋白,已推出一系列预偶联新冠抗原的磁珠产品。我们的磁珠由具有超顺磁性的微米级氧化铁颗粒组成,通过表面偶联不同的蛋白,可以特异性结合不同生物配体并实现快速、高效的磁性分离。

磁珠的使用步骤十分简便,通常由孵育、磁分离、洗脱三步组成,只要利用外加磁场就可以进行独立于生物反应的操作,适用于多种实验应用,例如抗体捕获/筛选、病毒富集、细胞分选等。



01
验证数据


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可高灵敏度捕获抗体

Immobilized 40 μg SARS-CoV-2 S protein RBD/1 mg beads can bind the Anti-SARS-CoV-2 Spike S1 Antibody with an EC50 of 0.8887 μg/mL (QC tested).

点击申请protocol


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可高灵敏度结合受体


Immobilized 40 μg SARS-CoV-2 S protein RBD/1 mg beads can bind the Human ACE2, Fc Tag (AC2-H5257) with an EC50 of 1.008 μg/mL (QC tested).

点击申请protocol


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具有良好的冻融稳定性

The binding curves between SARS-CoV-2 S RBD pre-coupling magnetic beads (Cat. No. MBS-K002) and anti-SARS-CoV-2 S1 antibody after different freeze-thaw cycles.

点击申请protocol



02
新冠类磁珠产品列表



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参考文献:

Greaney A. J., Loes A. N., Crawford K. H.D., et al. 2021. Comprehensive mapping of mutations to the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human serum antibodies. Cell Host & Microbe. doi: 10.1016/j.chom.2021.02.003


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