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【病理干货】HE染色步骤及常见问题解析

2024-03-28 10:24    浏览量:3639

HE染色步骤及常见问题解析

任何组织的切片,如果不进行染色就看不到组织的细微结构、看不到细胞核,无法分辨出肿瘤的良恶性,不能向临床医生提供诊断依据。所以染色在病理组织形态学的诊断、科研和教学工作中具有重要的实用价值。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。


HE染色概念



苏木精-伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining),简称HE染色法,石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。


HE染色试剂



  • - 二甲苯

  • - 梯度乙醇

  • - 苏木素染液

  • - 伊红染液

  • - 分化液

  • - 返蓝液

  • - 中性树胶固封剂


注意事项



  1. 1. 脱蜡要彻底。一般脱蜡彻底的切片呈透明状,脱蜡的彻底与否取决于环境温度、脱蜡液温度、脱蜡时间、切片数量等;

  2. 2. HE各染液的染色时间应根据组织类型不同、样本新旧、固定不同、环境温度不同、染液使用情况不同、切片厚度及切片数量来调整。一般来说新鲜组织易着色,陈旧组织较难着色;

  3. 3. 染色过程中水洗需注意自来水的酸碱性。如自来水呈酸性,则易使苏木素脱色,如自来水呈碱性,则易加快水溶伊红在乙醇中的脱色,应根据染液情况和自来水情况调整冲洗时间;

  4. 4. 脱水时,应控制切片在低浓度乙醇的时间,低浓度乙醇对伊红有洗脱作用;

  5. 5. 根据不同苏木素,是否需要分化反蓝,以及分化反蓝的时间均不相同,水溶或淳溶的伊红着色效果也不相同,在染色过程中进行镜检能达到更好的染色效果;

  6. 6. 中性树胶固封剂浓度要适中,浓度高时,不易散开、易产生气泡,浓度低时,易溢出切片、待二甲苯挥发后树胶易分布不均产生空泡;

  7. 7. 染色应在通风橱进行,避免或减少试剂对人体的伤害。


染色程序



  • - 二甲苯3缸,浸染5min;

  • - 无水乙醇2缸,浸染2min;

  • - 75%,85%,95%梯度乙醇各1缸,浸染1min;

  • - 自来水浸1min;

  • - 苏木素浸染5-8min;

  • - 自来水冲洗;

  • - 分化:根据分化液不同,数秒或数分钟不等;

  • - 自来水冲洗;

  • - 反蓝:根据返蓝液不同,数秒或数分钟不等;

  • - 自来水冲洗;

  • - 伊红浸染1-5min;

  • - 自来水冲洗;

  • - 75%、85%、95%梯度乙醇各1缸,浸染10-20s;

  • - 无水乙醇2缸,浸染1-2min;

  • - 二甲苯2缸,浸染2min;

  • - 中性树胶固封。


HE切片技术标准



  • - 组织完整;

  • - 厚薄均匀;

  • - 染色清晰,对比度高;

  • - 无明显褶皱、破损、刀痕、裂隙等;

  • - 着色无污染;

  • - 固封适中,无气泡、空腔,透明度好。


常见问题




染色过程中切片脱落
  • ● 组织本身如凝血块、血栓、分泌物等,干涸或过硬的组织及组织破碎等,染色时易脱落。可尝试使用防脱片;

  • ● 组织脱水、透明不佳,石蜡未完全浸透,组织较软,切片脱蜡时收缩,染色时又膨胀,进而易脱片。可尝试重新脱水;

  • ● 组织脱水浸蜡时间过长或温度过高,组织过硬、过脆,切片时不易完整,且易脱片。可尝试在切面敷乙醇或乙醇甘油后切片。


切片染色不均
  • ● 组织固定不当,固定好的部位着色清晰,未固定好的部分着色模糊;

  • ● 组织脱水不佳,部分组织内含水,导致浸蜡不充分,造成部分染色出现灰染可尝试重新脱水;

  • ● 切片薄厚不均或有横纹;

  • ● 切片脱蜡不充分,含蜡部分着色浅或不着色;

  • ● 切片上有气泡,导致与染液接触不充分。


染色片有污染
  • ● 展片台,水面有杂质或碎屑;

  • ● 切片机刀头有组织碎屑或杂质,易粘黏到蜡带上;

  • ● 染色液中有污染、碎屑、色素颗粒、沉渣等。


部分染色图例展示



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