1、石蜡切片：对于石蜡包埋的组织，首先进行切片，通常厚度为5微米；
2、冰冻切片：对于冰冻的组织，进行冰冻切片处理。
1、对于石蜡切片，首先进行脱蜡处理。这通常包括在二甲苯I和二甲苯II中各浸泡0.5小时；
2、水化：切片随后通过一系列不同浓度的酒精溶液（如70%、80%、90%、95%、100%）进行水化，每个浓度浸泡时间各异，通常前三个浓度各浸泡2分钟，后两个浓度分别浸泡5分钟和10分钟。
使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗切片数次，每次清洗时间约为5分钟，以确保样本的清洁。
1、准备抗原修复液（如pH=6.0的10 nM柠檬酸抗原修复液），将切片放入修复液中；
2、使用微波炉或高压锅等方法加热修复液至沸腾，持续一定时间（如10分钟到数分钟），以促进抗原的暴露；
3、加热后，让切片自然冷却至室温。
使用内源性过氧化物酶阻断剂或其他封闭剂处理切片，以消除非特异性背景染色，处理时间通常为20分钟。
滴加特异性的一抗（如抗体稀释液），确保抗体均匀覆盖组织切片，然后在适当的温度（如室温或4°C）下孵育一定时间（如1小时到过夜）。
使用PBS清洗切片数次，以去除未结合的一抗和其他杂质。
滴加与一抗对应的二抗（如荧光标记的二抗或酶标记的二抗），在适当的温度下孵育一定时间（如30分钟到1小时）。
如果使用的是酶标记的二抗，需要添加显色底物（如DAB）进行显色反应，显色时间根据具体情况而定（如2-10分钟）。
如果需要，可以使用苏木精等染料对切片进行复染，以增加对比度；
使用甘油或其他封片剂封片，以便在显微镜下观察。
在显微镜下观察切片，记录和分析结果。
1、切片必须完整、均匀、平整、无褶皱，这有利于在染色时的冲洗和切片的牢固附黏；
2、切片不平整可能导致染色不均匀，颜色深浅不一。
1、组织块取材不能太大过厚，以确保脱水完全；
2、脱水不完全可能导致浸蜡不彻底，切片不完整。
对于离体的组织尽量快地进行固定，以保持组织的抗原性。
1、脱蜡必须干净，否则会影响免疫组化染色的最后结果；
2、脱蜡时间应根据季节、室温、试剂新鲜度等因素决定，原则上要彻底、干净。
• 内源性酶和生物素的去除：
1、使用3%过氧化氢水溶液等方法去除内源性酶，但注意过氧化氢浓度不能过高，时间不宜过长；
2、在采用生物素方法染色前，应将组织切片进行0.01%卵白素溶液处理，以消除内源性生物素的活性。
1、长时间的孵育不利于临床病理报告的发出；
2、一抗孵育时间可在10分钟、20分钟或30分钟，一般在室温中进行，如室温低于20℃，可在37℃的孵育箱中进行。
1、必须正确选用连接抗体，以避免假阴性现象；
2、连接抗体要根据选用的抗体来进行，例如第一抗体选用的是单克隆鼠抗人抗体，连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG。
1、冲洗应单独进行，防止交叉反应造成污染；
2、冲洗应温柔，防止切片的脱落；
3、冲洗的时间要足够，以彻底洗去结合的物质。
抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索，尤其是对于一抗孵育，可能需要在4度过夜。
如果切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色，可以通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体、增加封闭时间和浓度等方法来控制。
1、加反应液时要覆盖组织充分，每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；
2、用组化笔画圈时尽量画大一点，避免墨水排斥液体，引起片周边干片；
3、在免疫组织化学染色实验中，每一步骤都可能对最终结果产生影响，因此严格遵守实验步骤和注意事项对于确保结果的准确性和可靠性至关重要。
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