R2mAb技术与独特型抗体开发

一、    R2mAb^®技术介绍

Rabbit Recombinant Monoclonal Antibody技术，又称R2mAb^®技术，系Biolynx Technology Inc.专利的重组单抗开发平台。该平台在传统实验动物免疫的基础上，使用特殊的抗原特异性外周血淋巴分离技术，结合单个B细胞体外扩增培养技术和IgG重组表达技术，以及开发过程中贯穿始终的基于终端应用设计优化的层层筛选，最终获得序列唯一的重组表达并生产的兔单克隆抗体的技术。

图一：R2mAb^®技术流程

传统的单克隆抗体开发是基于啮齿类动物的杂交瘤技术的，相比啮齿动物而言兔子具有更加复杂的免疫系统，可以产生更为复杂多样的抗体分子，有能力识别更多、更精细的抗原表位，也具有更高的抗体亲和力。传统免疫学中，兔多抗技术常常用于替代鼠单抗技术用于开发高难度的抗体，但是由于多抗技术的限制，往往无法分离到单纯针对某一精细表位的抗体，也不能持续得到特性均一的抗体产品，更难以在多抗的基础上进行抗体工程改造。上世纪90年代末，兔杂交瘤技术的出现使科学界获得了更为理想的抗体开发工具。

R2mAb^®技术是在兔杂交瘤技术之后进行的又一次革命性的突破。相比于兔杂交瘤技术，R2mAb^®平台技术更加先进——高通量重组单克隆抗体开发技术不需要通过处死动物并从脾脏中获取淋巴细胞，仅需取少量外周血并分离抗原特异性B细胞，扩增培养后通过分子生物学方法克隆抗体基因，并在哺乳动物细胞中进行重组表达生产。外周血的可重复获取性带来了近乎无限的筛选容量、高效的重组技术替代杂交瘤细胞培养和亚克隆缩短了开发周期、重组表达和无血清培养带来了高批间稳定性、可线性放大的培养工艺带来了高抗体产量，多重技术优势保证了R2mAb^®平台的高效性、稳定性和可放大性，特别适用于对抗体筛选需求高，对抗体批间稳定性敏感的工业领域和前沿学术研究，例如体外诊断、食品安全、药物研究等领域。

二、    抗独特型抗体

        抗体的独特型（idiotype，Id），是 Kunkel 等于 1963 年提出的，指抗体VH-VL部位中特异性针对抗原决定簇的部分，也就是抗原互补区，是每一株抗体区别于所有其它抗体的特征性结构。抗独特型抗体（anti-idiotypic antibody，AId），又被称为“抗抗体”，但并不是通常意义上识别抗体恒定区域的二抗，而是一种能够直接识别并结合某一株抗体可变区的抗体。一部分AId与原来抗原的决定簇分子互为“内影像”关系，可模拟抗原结构和功能的作用，而可以作为一种新型疫苗；也经常在抗体药物临床前及临床研究中用于药物分子残留的检测，根据AId与靶抗体结合位点的精细差异，在抗体药物药代动力学（PK）和药效学（PD）分析中，可用于检测不同状态抗体药物的含量，包括游离型、结合型和总抗体量。

图二：三种不同类型的抗独特型抗体

抗独特型抗体在抗体药物研发领域有丰富的应用，作为强大的免疫学检测和功能分析工具，其主要的使用方向包括药代动力学/药效学分析和药物的免疫原性分析。

药代动力学（PK）和药效学（PD）分析

抗体药物的PK/PD研究主要考察机体中药物代谢的动态变化，包括药物在机体内的吸收、分布、代谢和排泄四个主要环节。其主要技术手段是检测血液和其它生物样本中特定抗体药物的含量，包括游离型、结合型和总药物含量。

        抗体药物的化学本质是免疫球蛋白分子或其改进分子，其抗原结合部位有三个超可变区，这些区域直接参与了抗体-抗原的结合，又称为互补决定区（CDR）。由于抗独特型抗体是针对某一CDR区，所以部分抗独特型抗体具有中和活性（能阻断抗体与抗原结合），另一部分则不具有中和活性。使用不同类型的抗独特型抗体能实现灵活的各类检测，包括非结合态药物、总抗体药物、结合态抗体药物含量的检测。

抗体药物的免疫原性分析

几乎所有的抗体药物进入人体内都会引起一定的抗药抗体（anti-drug antibody, ADA）反应，即免疫原性。免疫原性可能会导致严重的临床症状，包括过敏、自身免疫以及改变药物原有的药代动力学特征（例如，药物中和、异常分布和药物清除率增加等均可能会使药物的疗效发生改变）。因此免疫原性分析是药物临床研究的一项重要内容。

FDA对于免疫原性分析试验的开发，建议了几种常规方法，抗独特型抗体可作为理想工具参与这些分析体系的建立：

• ELISA 直接法测定（Direct binding ELISA）
• 桥接 ELISA（Bridging ELISA）
• 放射免疫沉淀测定（Radioimmuno precipitation assay, RIPA）
• 表面等离子体共振（Surface Plasmon resonance, SPR）
• 电化学发光测定（Electrochemiluminescence assay）

除在抗体药物研发方向的应用之外，抗独特型抗体还能用于疫苗开发。

疫苗开发

一部分具有中和活性的抗独特型抗体具有类似于其目标抗体对应的天然抗原决定簇的构象特征，这样的抗独特型抗体也被称为抗原内影像。这是因为其CDR区构型与抗原表位相似，能与抗原竞争性地和靶抗体的CDR区结合。因此，抗独特型抗体又可以用作疫苗开发的免疫原，特别是如果抗原具有毒性或易感染性，或者是天然抗原不易提取及纯化的情况下。

三、    R2mAb^®技术在抗独特型抗体开发中的应用

Biolynx的R2mAb^®团队具有十余年的各种功能性抗体的开发经验，在抗独特型抗体领域也有多年的开发和应用经验。应用先进的抗原制备技术及高分辨率的重组抗体平台，开发了多个抗体药物的抗独特型抗体，为抗体药物的研究提供了坚实有力的技术支持。

R2mAb^®平台开发抗独特型抗体，使用纯化的抗体/抗体Fab作为免疫原，筛选阶段使用多种同型对照抗体进行负筛选，并模拟终端临床应用进行产品性能鉴定，避免使用过程中的交叉反应和干扰物的影响。

图三：两株抗抗体药物独特型抗体的直接结合ELISA鉴别，AId clone1,2均能特异性识别目标IgG而与同型对照IgG无交叉反应。Plot1:系列浓度的AId clone1与目标IgG的ELISA反应强度；Plot2:系列浓度的AId clone2与目标IgG的ELISA反应强度；Plot3:系列浓度的AId clone1与同型对照IgG的ELISA反应强度；Plot4:系列浓度的AId clone2与同型对照IgG的ELISA反应强度。

图四：两株抗抗体药物独特型抗体的中和活性鉴别。使用AId与目标IgG预反应，然后将混合物与包被的目标IgG靶分子进行ELISA反应。Clone1:具有中和活性的抗独特型抗体，在一定浓度以上可抑制目标IgG与其靶点的结合；Clone2:不具有中和活性的抗独特型抗体，对目标IgG与其靶点的结合无明显抑制作用。