在过去的数十年间，单克隆抗体（mAb）作为一类药物应用在疾病的治疗中发挥了重要作用。随着人们对疾病相关生物分子理解的增加，单抗生产技术的进步，越来越多的分子靶点被鉴定出来用于药物治疗，促进了众多单抗应用的肿瘤免疫靶向治疗时代的到来。随着「精准医疗」的不断推进，以治疗性单抗血药浓度检测作为患者个体化治疗的用药参考将是一个趋势。
本期小编将为您介绍一下治疗性单抗药物的发展，以及其在人或动物体内血药浓度测定方法及应用开发概况。
一、肿瘤免疫治疗及单抗药物发展历程
肿瘤免疫治疗被称为继手术、放疗、化疗后第四种疗法。这种方法起源于非特异性免疫，但是低效、副作用大；而相反，新的免疫治疗是激活特异性、重要的免疫细胞，直接靶向性攻击癌症细胞，提高了疗效和安全性，已成为目前全球研究的热点。肿瘤免疫治疗包括细胞因子疗法、抗体疗法、过继细胞治疗（孙建，2015），其中治疗性单抗药物在肿瘤免疫治疗占据举足轻重的地位（肿瘤免疫及治疗性单抗发展历程见图 1 和图 2）。
图 1 肿瘤免疫及治疗性单抗发展历程（1）：从 coley 毒素到 ADC
图 2 肿瘤免疫及治疗性单抗发展历程（2）：免疫检验点单抗兴起
二、药代动力学（PK）和临床血药浓度监测（TDM）
血清中血药浓度的检测在药代动力学（pharmacokinetics, PK）实验中比较常见，通过系统性检测动物或人血清中血药浓度来分析药物在动物或人体内的吸收、分布、代谢和排除（即 ADME）情况。其意义包括预测血药水平，制定最佳给药方案，剂量和给药频度，指导合理用药；进行生物等效性，分析药物相互作用及浓度监测；设计新药，改进药物剂型，设计合理的给药方案等。
目前比较热门的两大治疗类单抗分别为治疗自身免疫类疾病的单抗（如类风湿性关节炎、肠炎、哮喘等）和抗肿瘤类单抗（如实体瘤、血液类恶性肿瘤）（表 1）。虽然最初的响应率在 50-90%，许多患者能从单抗治疗中获益， 但大多数患者最初的反应会随着时间的推移而消失，导致疾病进展（Oude Munnink et al., 2016)。而对于单抗治疗响应的缺乏或丧失是由多种原因造成的，包括对表观遗传、生物分子或病理生理学机制缺乏了解，以及对血清中单抗浓度未充分了解可能是最基础的原因。因此，尽管对于抗炎类和抗肿瘤单抗均尚未充分认识，基于患者个体血清中治疗药物监测（therapeutic drug mornitoring, TDM）有待成为个性化靶向单抗治疗的下一个维度的研究。此外，治疗性单抗的 TDM 评价可以作为临床治疗标准制定的指导性标准（图 3），为开发标准化、经验证、用途广泛、成本低、快速、简单的单抗定量分析技术提供参考。
表 1 FDA 和 EMA 获批的用于抗炎和肿瘤疾病类单抗药物
图 3 用于 mAb 治疗性药物监测（TDM）指导临床决策的通用治疗算法
三、治疗性单抗药物血药浓度检测方法
目前，用于单抗浓度测定的方法包括固相酶联免疫吸附测定（ELISA），流体液相放射免疫测定，流体液相移动性测定和报告基因测定，最常用的技术是 ELISA。针对治疗性单抗的定量，近年来开发出多种方法，最主要是配体结合实验（LBAs），用以检测抗体-抗原相互作用，因其高灵敏度、少量样本需求、高通量和低成本而成为优选方案（Kuang et al., 2010）。下面介绍几种有代表性的用于定量治疗性抗体的免疫实验方法。
抗原捕获抗体检测（抗原捕获实验）
此检测方法首先将重组抗原（靶点）直接、或通过生物素/其他抗体吸附于固相上。然后使治疗性单抗与抗原结合，并通过标记的二抗进行检测。此方法是单抗定量最常用的方法。当没有现成可用的重组抗原蛋白时，在细胞表面表达有靶点抗原的细胞也可以捕获治疗性单抗，随后被捕获的抗体通过标记的二抗检测（图 4）。
图 4 抗原捕获抗体实验原理
抗体捕获抗原检测（桥联实验）
该检测方法利用抗体的二价特性。首先靶点（抗原）直接、或通过生物素/其他抗体固定在固相上。然后治疗性单抗与抗原结合，随后被标记的抗原分子检测。这类实验在原则上只能检测游离药物，因为无论在捕获或检测中单抗的两个结合位点都会被同时用到（图 5）。
图 5 抗体捕获抗原实验原理
抗独特型抗体捕获实验
在这类实验中，针对药物的特异性抗独特性抗体直接、或通过生物素/其他抗体固定在固相上。治疗性单抗首先被抗独特型抗体捕获，随后通过另外的抗独特型抗体或抗同型抗体检测。此类实验从原理上能够检测游离的或部分结合的药物，如果捕获抗独特型抗体与靶点存在直接或间接竞争。然而，如果捕获抗独特型抗体不能阻断药物与靶点的结合，与抗独特型抗体配合检测，该实验从原理上讲可以检测所有类型的药物（游离、部分结合和全部结合）（图 6）。
图 6 抗独特型抗体捕获实验原理
抗种属抗体捕获&检测（通用实验）
在该实验中，治疗性单抗被抗种属抗体（如抗人 Fc）捕获，然后被另外一种抗种属抗体（如抗人 Fab）检测。该实验，经常指通用实验，不是特异性针对药物而是对特定物种的 IgG 骨架，用以检测所有具有相同骨架的抗体。因此，理论上讲，这类实验能够通常，但不是一直能够检测所有药物（总药量）。由于内源性 IgG 的干扰，该实验不适合对人血清中的人或人源治疗性抗体类单抗的定量（图 7）。
图 7 抗种属抗体捕获实验原理
竞争实验
上述所有非竞争性实验都可以转换成竞争实验。在竞争实验中，抗原和捕获抗体被直接、或通过生物素/其他抗体吸附在固相上。然后，其他标记（如同位素或生物素标记）的治疗性抗体与未标记的治疗性抗体与捕获物产生竞争。所检测得到治疗性单抗的水平与样品中药物的量成反比关系。该实验实际上可以根据捕获物的种类能够检测不同的单抗（图 8）。
图 8 竞争实验原理
不同患者间血清中单抗浓度具有显著差异，且造成这种差异的影响因素很多。越来越多的暴露性分析实验应用于单抗检测，这些研究表明处于低血药浓度患者面临治疗失败的风险。且鉴于治疗性单抗价格不菲，通过实时监控血药浓度有助于及时调整用药剂量，在治疗期间能够为患者节省医疗费用。
ACROBiosystems 致力于为抗体药物研发提供全套解决方案，不仅提供高质量的靶点蛋白，在基于临床前、临床 PK 实验、ADA 检测、临床患者血药浓度适时监测等方面也提供相关产品和解决方案。在血药浓度检测方面，我们与中国医学科学院肿瘤医院等多家机构建立了全方位的合作关系。
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特征
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详细说明
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灵敏度
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0.15625 μg/ml
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检测范围
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5 μg/ml-0.15625 μg/ml
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精确度
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批内差 < 12.1% 批间差 < 14.8%
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准确度
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批内差: 0.5%-9.9%
批间差: 2.7%-11%
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回收率
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80%-120%
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检测对象
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人血清，鼠血清，猴血清
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稳定性
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48 h室温稳定，检测结果差异（%Diff.）<17.8%。
3个循环冻融 (-80℃)实验，相对误差（%Diff.）< 11.3%。
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平行性
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三种浓度(25 μg/ml, 5 μg/ml, 1 μg/ml) PD-1抗体5倍稀释成独立的重复样本进行检测。相对误差（%Diff.）< 14.1%。
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稀释线性
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将PD-1抗体进行不同浓度1:125, 1:25,1:5稀释，最终检测浓度是1 μg/ml。相对误差（%Diff.）< 18.2% 。
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• 相关数据
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Reference:
孙建，药学进展 (2015), 39 (12): 921-935。
Oude Munnink et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics (2016), 99(4): 419-431.
Bing Kuang et al., Bioanalysis (2010) 2(6): 1125–1140.
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