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SPR & BLI:蛋白结合活性分析平台

从抗体药物应用出发,保障蛋白质量

背景
对于重组蛋白产品的质量控制,不仅需要进行结构及理化性质检测,同时也需要对蛋白的结合活性、功能活性等生物活性进行检测。
ELISA是最经典的蛋白结合活性分析方法之一,具有成本低、操作简单等优势,在常规蛋白结合活性检测中广泛应用。但采用ELISA方法进行活性分析时也存在一些局限性:1)由于其依赖二抗及酶放大效应,检测相同标签蛋白或较弱活性蛋白时,不易获得准确结果;2)ELISA属于终点检测法,无法检测蛋白结合动力学情况。
亲和力是判定分子间相互作用的重要参数,是了解分子以及识别生物学过程、药物的发现与筛选等的重要指标。对于药效的评价、生物大分子及其复合体的稳定性的评估需要从动力学、热力学和热稳定性等方面进行包括分子间的结合、结合的快慢、结合的强弱、结合的机理等多方面的全面性研究。
ACROBiosystems坚持从客户出发,蛋白产品质控充分考虑客户的实验应用,合理设计质控方案和标准,引入先进的表面等离子共振(SPR)和生物膜干涉技术(BLI)平台进行蛋白的活性及亲和力的检测,并将其作为生产质控检测项目,保证更多的蛋白产品能够满足抗体药物开发的各类应用。
技术原理&优势

表面等离子共振(SPR)

表面等离子共振(SPR)原理是当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面时,可引起金属自由电子的共振,由于共振致使电子吸收了光能量,从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中,使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化,而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化,得到生物分子之间相互作用的特异性信号。

技术优势:
无须标记
灵敏度高
可测量较宽范围的亲和力
实时监测,精准的数据分析
 SPR检测原理
图1 SPR检测原理
SPR平台(Biacore 8K、Biacore T200)
图2 SPR平台(Biacore 8K、Biacore T200)
SPR有极高的灵敏度及较广的检测范围,可以应用于μM以下水平、响应信号极低或是pM水平的超高亲和力检测(图3-A & B)。
Cat. No. ADB-Y19

Fig 3-A Anti-Adalimumab Antibodies (mouse IgG1, Cat. No. ADB-Y19) captured on CM5 chip via anti-mouse antibodies surface, can bind human adalimumab with an affinity constant of 1.36 pM.

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Cat. No. IG7-H5240

Fig 3-B Human IGFBP-7, His Tag (Cat. No. IG7-H5240) immobilized on CM5 Chip can bind Human C1q R1, His Tag (Cat. No. C11-H5228) with an affinity constant of 0.223 μM as determined in a SPR assay.

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表面等离子共振(SPR)

生物膜干涉技术(BLI)实时监测分子间相互作用是通过生物传感器来实现的,光通过传感器的生物膜层后会发生透射与反射,反射光的频率受到生物膜层厚度的影响。一些频率的反射光会与入射光产生相长干涉现象,而另一些受到了相消干涉。这些干涉光波被光谱仪所检测到,并形成一幅干涉光谱,并以干涉光谱的相对位移强度(nm)显示。因此,结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减,光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移,而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度。

技术优势:
无须标记
检测通量高,灵敏度高
样品无需预处理
实时监测,半自动化检测,可提供精确的动力学数据
BLI技术原理
图4 BLI技术原理
BLI平台(ForteBio Octet 96e)
图5 BLI平台(ForteBio Octet 96e)
BLI对样品缓冲液无特殊要求,省去样品的前处理,整个检测时间相对较短,可以更快的响应客户需求,进行多种数据的同时检测(图6)。
Fig 6 Affinity test between RBD mutants, variants and Human ACE2 by BLI assay

Fig 6 Affinity test between RBD mutants, variants and Human ACE2 by BLI assay

虽然SPR和BLI原理不同,但多数情况下检测的结果水平基本一致,可以更好的评价数据的可靠性(图7-A & B)。
Cat. No. PD1-H5257

Fig 7-A Human PD-1, Fc Tag (Cat. No. PD1-H5257) captured on CM5 chip via anti-human IgG Fc antibody, can bind Human PD-L1, His Tag (Cat. No. PD1-H5229) with an affinity constant of 3.6 μM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested).

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Cat. No. PD1-H5257

Fig 7- B Loaded Human PD-1, Fc Tag, low endotoxin (Cat. No. PD1-H5257) on ProteinA Biosensor, can bind Human PD-L1, His Tag (Cat. No. PD1-H5229) with an affinity constant of 5.3 μM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (QC tested).

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SPR和BLI两个平台原理不同,在分子间相互作用力的检测中也各具优势。总的来说,SPR和BLI不依赖于标签且有极高的灵敏度,可提供高质量动力学、亲和性、特异性、选择性的数据,实时监测蛋白结合和解离的快慢强弱,是检测相同标签蛋白活性、弱结合蛋白活性或常规蛋白间相互作用的重要手段,可用于生物分子作用的详细分析,适用范围从早期药物研究到开发,直至质量控制。
ACRO同时拥有两种平台,可根据蛋白类型不同,属性不同,快速有效的选择单一平台或是两种平台进行活性验证。
应用案例

ACROBiosystems致力于运用更多更全面的生产及质控平台为客户提供高质量的重组蛋白。从客户实际的应用出发,合理设计实验验证蛋白活性的同时,可以免费提供详尽的protocol,展示检测细节,节省您实验摸索的时间及物料成本。

抗体与Fcγ受体和FcRn的结合能力检测

ACROBiosystems所有Fcγ受体和FcRn均使用SPR和BLI双平台检测(图8-A & B)。
Cat. No. FCA-H52H1

Fig. 8-A Herceptin captured on Protein A Chip can bind Human CD64, His Tag (Cat. No. FCA-H52H1) with an affinity constant of 0.108 nM as determined in SPR assay (Biacore 8K) (Routinely tested).

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Cat. No. FCA-H52H1

Fig. 8-B Loaded Herceptin on Protein A Biosensor, can bind Human CD64, His Tag (Cat. No. FCA-H52H1) with an affinity constant of 0.297 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).

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SPR或BLI作为批批检方法,保障了每一批受体蛋白的亲和力活性及结合信号强弱的高度一致性(图9)。
Cat. No. CDB-H5228

图9. SPR验证,固定在CM5芯片上的Human Fc gamma RIIB / CD32b Protein (Cat. No. CDB-H5228)可以结合Rituximab (利妥昔单抗),亲和常数为10 μM (Biacore T200)。

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Cat. No. CDB-H5228

图10. 用相似度评分软件分析可以看到,不同批次的Human Fc gamma RIIB / CD32b ( Cat. No. CDB-H5228 ) 相似度在90%以上。

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此外,为了满足客户更多的需求,同时建立将抗体作为固定相的方法。
采用Protein A捕获或CM5直接固定抗体的方法测定,检测结果表明不同方法检测Fcγ受体与人IgG1抗体亲和力无明显差异。(图11-A & B & C & D)。
Cat. No. CDB-H5228

Fig. 11-A Immobilized Human CD32b/c, His Tag (Cat. No. CDB-H5228) on CM5 Chip via anti-His antibody can bind Rituximab with an affinity constant of 10.1 μM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (QC tested).

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Cat. No. CDB-H5228

Fig. 11-B Rituximab immobilized on CM5 Chip can bind Human CD32b/c, His Tag (Cat. No. CDB-H5228) with an affinity constant of 4.09 μM as determined in SPR assay (Biacore 8K) (Routinely tested).

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Cat. No. CDB-H5228

Fig. 11-C Loaded Human CD32b/c, His Tag (Cat. No. CDB-H5228) on HIS1K Biosensor, can bind Rituximab with an affinity constant of 4.30 μM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).

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Cat. No. CDB-H5228

Fig. 11-D Loaded Rituximab on FAB2G Biosensor, can bind Human CD32b/c, His Tag (Cat. No. CDB-H5228) with an affinity constant of 5.4 μM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).

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抗原和抗体的结合能力检测

分别采用SPR和BLI方法检测BCMA蛋白和抗-BCMA单抗的结合活性(图12-A&B)。
Cat. No. BCA-H522y

Fig 12-A Anti-Human BCMA MAb (human IgG1) captured on CM5 chip via Anti-Human IgG Fc antibodies surface, can bind Human BCMA, His Tag (Cat. No. BCA-H522y) with an affinity constant of 13.0 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested).

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Cat. No. BCA-H522y

Fig 12-B Loaded Anti-Human BCMA MAb (human IgG1) on Protein A Biosensor, can bind Human BCMA, His Tag (Cat. No. BCA-H522y) with an affinity constant of 29.1 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).

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采用SPR方法检测CD3抗原与CD3×BCMA双抗的结合能力。(图13)
Cat. No. CDD-H52W1

Fig.13 Bispecific T-cell Engager (CD3 X BCMA) immobilized on CM5 Chip can bind Human CD3E&CD3D Heterodimer Protein, His Tag&Tag Free (Cat. No. CDD-H52W1) with an affinity constant of 31.8 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200).

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多种属交叉实验

采用SPR方法,分别验证Cynomolgus CD20 Full Length, His Tag (Cat. No. CD0-C52H8)与Rituximab单抗、Ofatumumab单抗的结合能力。(图14-A&B)
Cat. No. CD0-C52H8

Fig 14-A Rituximab captured on CM5 chip via anti-human IgG Fc antibody can bind Cynomolgus CD20 Full Length, His Tag (Cat. No. CD0-C52H8) with an affinity constant of 5.48 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200) (Routinely tested).

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Cat. No. CD0-C52H8

Fig 14-B Ofatumumab captured on CM5 chip via anti-human IgG Fc antibody can bind Cynomolgus CD20 Full Length, His Tag (Cat. No. CD0-C52H8) with an affinity constant of 3.51 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200) (Routinely tested).

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采用BLI方法,分别验证Human CD47, His Tag,(Cat. No. CD7-H5227)和Cynomolgus / Rhesus macaque CD47, His Tag (Cat. No. CD7-C52H1)与anti-CD47抗体的结合能力。(图14-C&D)
Cat. No. CD7-H5227

Fig 14-C Loaded Anti-Human CD47 MAb (Human IgG4) on AHC Biosensor, can bind Human CD47, His Tag (Cat. No. CD7-H5227) with an affinity constant of 6.18 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).

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Cat. No. CD7-C52H1

Fig 14-D Loaded Anti-Human CD47 MAb (Human IgG4) on AHC Biosensor, can bind Cynomolgus / Rhesus macaque CD47, His Tag (Cat. No. CD7-C52H1) with an affinity constant of 2.93 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).

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蛋白与小分子结合能力检测

为了满足不同研究方向客户需求,基于ACRO丰富的SPR和BLI大分子亲和力的检测经验,同时持续开发多种分子互作类型亲和力检测,如蛋白与小分子结合(图15)。
采用SPR技术检测Human HSA Protein, His Tag (Cat. No. HSA-H5220)与Naproxen Sodium(一种镇痛消炎的小分子药物)的结合能力。
Cat. No. HSA-H5220

Fig 15 Human HSA Protein, His Tag (Cat. No. HSA-H5220) immobilized on CM5 Chip can bind Naproxen Sodium with an affinity constant of 41 μM as determined in a SPR assay (Biacore T200).

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ACROBiosystems基于Biacore平台与ForteBio Octet平台为生物医药研发客户提供相应的分子互作分析测试服务,能够实现对蛋白,抗体及Fab片段等相互作用的定性定量分析,主要服务包括抗体筛选、表征、一致性评价以及生物大分子间相互作用等,助力于生物医药的发展。
能力认证
高标准的质量管理控制体系,保证产品及服务质量

ACROBiosystems有着严格的质量管理控制体系,已按照ISO9001:2015“质量管理体系要求”/ISO 13485:2016“医疗器械质量管理体系用于法规的要求”等国际标准建立、实施并保持和持续改进质量管理体系。

高水准通过中检院大分子生物样本检测能力验证

2019年1月24日中国食品药品检定研究院发布了关于组织开展“首个单克隆抗体生物药生物分析能力验证项目”的通知,ACROBiosystems积极报名并参与了“NIFDC-PT-195-生物样本检测-猴血清中贝伐珠单抗的浓度”能力验证项目,并成功通过此次能力验证。

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