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"膜杰作"—多次跨膜靶点蛋白开发技术平台及系列产品

背景
多次跨膜靶点蛋白(ACROBiosystems均可提供)
图1.多次跨膜靶点蛋白(ACROBiosystems均可提供)
跨膜蛋白是嵌入细胞膜磷脂双分子层中实现细胞内外跨越的一类蛋白,跨膜区域的相互作用是连接膜外环境与细胞内环境的重要渠道,以此来执行各种激活和应答反应实现信号转导,调控细胞内外的形态和功能上的改变。许多人类疾病或许都与异常的跨膜蛋白功能有关,跨膜蛋白的多功能性使它们成为理想的药物作用靶点
具有全长完整结构的多次跨膜靶点蛋白具有重要意义,CD20为例,已有研究证实Rituximab对CD20的识别不止有一级表位ECL2,还识别其二级表位ECL1/ECL2,二级表位ECL1/ECL2还会影响Rituximab的CDC效应[1]。然而,多次跨膜蛋白结构复杂,具有多个疏水跨膜区,往往在宿主细胞中表达水平极低。
针对多次跨膜靶点蛋白全长的制备难点,为助力多次跨膜蛋白靶标的药物研究,ACROBiosystems专门搭建了多次跨膜蛋白研发生产的更全面的平台化解决方案,满足跨膜靶点蛋白不同应用场景的需求,提供种类齐全的全长多次跨膜蛋白包括四次跨膜蛋白CD20Claudin18.2,五次跨膜蛋白CD133,七次跨膜蛋白GPRC5DCCR5CCR8(图1)。
三大技术平台
VLP技术平台
VLP技术平台
技术原理

ACROBiosystems专门搭建了基于HEK293表达系统的VLP技术平台,将构象完整的膜蛋白直接聚集在细胞表面,使这些复杂的膜蛋白转变为可溶性的、高浓度的蛋白用于抗体免疫和筛选,所制备的包膜VLPs在其固有的细胞膜上显示正确折叠的多次跨膜蛋白,从而能够诱导和筛选识别靶标天然构象的功能性抗体。
ACROBiosystems除提供VLP技术平台下常规生产的多次跨膜蛋白之外,同时也接收 定制服务

独特优势
全长跨膜蛋白,具有完整ECD表位
VLP中靶抗原丰度高于过表达细胞
可提高免疫原性
100-150 nm,可作为树突状细胞和噬菌体展示的最佳靶点
可用于免疫/ELISA/SPR/BLI/细胞实验/CAR阳性率检测
膜蛋白-去垢剂技术平台
膜蛋白-去垢剂技术平台
技术原理

多次跨膜蛋白的跨膜区域疏水性较高,在普通的缓冲液中很难保持正确的构象,可以通过添加去垢剂解决该问题。以昆虫细胞表达技术和哺乳动物细胞表达技术为基础,ACROBiosystems专门搭建了困难药物靶点跨膜蛋白的表达平台和纯化平台,并且已经从常用的去垢剂中筛选出包括DDM/CHS(货号DC-11)在内的几种效果很好的去垢剂,大大增加多次跨膜靶点蛋白的水溶性,帮助其在溶液中形成天然正确的构象。

独特优势
全长跨膜蛋白,不仅仅具备完整ECD表位
可精确定量
可应用于免疫/ELISA/SPR/BLI
Nanodisc技术平台
Nanodisc技术平台
技术原理

“Nanodisc”的磷脂层结构,是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构,跨膜蛋白移除去垢剂后可以整合到Nanodisc的特殊结构中,保持其生物学活性并有很好的水溶性,应用更广泛。ACROBiosystems是国内唯一一家经University of Illinois许可使用的Nanodisc跨膜蛋白产品供应商,研发团队经过不断优化改进,已成功摸索出适用于工业化放大生产的Nanodisc组装工艺,实现了跨膜蛋白Nanodisc产品的长期稳定供货。

独特优势
全长的跨膜蛋白处于近似天然膜环境中,保持生物活性
具有良好的水溶性,无需去垢剂
国内唯一一家获得专利持有方的授权,使用更安心
可用于免疫/ELISA/SPR/BLI/细胞实验/CAR阳性率检测
产品列表
  • VLP平台
  • 膜蛋白-去垢剂平台
  • Nanodisc平台
分子 货号 产品描述 应用 订购/预购
Claudin18.2 CL2-H5547 Human Claudin18.2 Full Length Protein-VLP (HEK293) 免疫
ELISA
SPR/BLI
细胞实验
CAR阳性率检测

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GPRC5D GPD-H52P5 Human GPRC5D Full Length Protein-VLP (HEK293)

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CCR5 CC5-H52P3 Human CCR5 Full Length Protein-VLP (HEK293)

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CCR8 CC8-H52P4 Human CCR8 Full Length Protein-VLP (HEK293)

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CD20 CDP-H52P6 Human CD20 Full Length Protein-VLP (HEK293)

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VLP VLP-H52C5 Virus-Like Particle (VLP) isotype control VLP同型对照

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分子 货号 产品描述 应用 订购/预购
CD20 CD0-H52H3 Human CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His Tag (HEK293) (SPR verified) 免疫
ELISA
SPR
BLI

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CD20 CD0-H82E5 Biotinylated Human CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His,Avitag™ (HEK293)

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CD20 CD0-C52H8 Cynomolgus CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His Tag

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Claudin18.2 CL2-H5546 Human Claudin-18.2 Protein, His Tag (active membrane protein)

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Claudin18.2 CL2-H82E3 Biotinylated Human Claudin-18.2 Protein, His,Avitag™(active membrane protein)

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CCR5 CC5-H52D1 Human CCR5 Protein, Flag,His Tag

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GPRC5D GPD-H52D3 Human GPRC5D Protein, Flag,His Tag

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CD133 CD3-H52H4 Human CD133 Protein, His Tag

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分子 货号 产品描述 应用 订购/预购
CD20 CD0-H52H1 Human CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His Tag (Nanodisc) (HEK293) 免疫
ELISA
SPR
BLI
细胞实验
CAR阳性率检测

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CD20 CD0-H82E3 Biotinylated Human CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His,Avitag™ (Nanodisc) (HEK293)

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CD133 CD3-H52H1 Human CD133 Full Length Protein, His Tag (Nanodisc)

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CD133 CD3-H82E6 Biotinylated Human CD133 Protein, His Tag (Nanodisc)

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GPRC5D GPD-H52D4 Human GPRC5D Protein, Flag,His Tag (Nanodisc)

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MSP1D1 APO-H51H3 Human MSP1D1 Protein, His Tag (Nanodisc) 同型对照

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MSP1D1 APO-H81Q5 Biotinylated Human MSP1D1 Protein, His,Avitag™ (Nanodisc) 同型对照

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案例展示

以下ELISA&SPR数据均可免费提供内部实验操作方法以供参考,点击申请Protocol即可获取。

Claudin 18.2-VLP
验证数据1
全长Claudin18.2-VLP(CL2-H5547)经过电镜观测,确保其正确组装。
CL2-H5547
验证数据2
经ELISA验证,抗嵌合Claudin18.2单克隆抗体可与全长Claudin18.2-VLP(CL2-H5547)特异性结合,线性区间为0.8-3 ng/mL
ELISA

Immobilized Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H5547) at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Chimeric Claudin-18.2 Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.8-3 ng/mL (QC tested).

申请 Protocol

验证数据3
经SPR亲和力验证,全长Claudin18.2-VLP(CL2-H5547)可与抗嵌合Claudin18.2单克隆抗体特异性结合,响应信号高,亲和力常数为1.24 nM
SPR

Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H5547) captured on CM5 Chip via Anti-Claudin-18.2 antibody can bind Anti-Claudin-18.2 antibody with an affinity constant of 1.24 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested).

申请 Protocol
CD20-DDM/CHS
验证数据1
经ELISA验证,全长CD20-DDM/CHS(CD0-H52H3)可与利妥昔单抗(Rituximab)特异性结合,线性区间为0.4-3 ng/mL
ELISA

Immobilized Rituximab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).

申请 Protocol

验证数据2
经ELISA验证,生物素标记全长CD20-DDM/CHS(CD0-H82E5)可与利妥昔单抗(Rituximab)特异性结合,线性区间为4-63 ng/mL
ELISA

Immobilized Rituximab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).

申请 Protocol

验证数据3
经SPR亲和力验证,生物素标记全长CD20-DDM/CHS(CD0-H82E5)可与利妥昔单抗(Rituximab)可与特异性结合,亲和力常数为1.73 nM
SPR

Biotinylated Human CD20, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) captured on Biotin CAP-Series S Sensor Chip can bind Rituximab with an affinity constant of 1.73 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200).

申请 Protocol
CD133-Nanodisc
验证数据1
经电泳(SDS-PAGE)验证, his标签的全长CD133-Nanodisc蛋白纯度高于90%
  
电泳(SDS-PAGE)验证

Human CD133 Full Length, His Tag (Nanodisc) ((Cat. No. CD3-H52H1))on SDS-PAGE under reducing (R) condition. The gel was stained overnight with Coomassie Blue. The purity of the protein is greater than 90%.

验证数据2
经ELISA验证,全长CD133-Nanodisc(CD0- CD3-H52H1)可与抗人源CD133(133-3) 单克隆抗体特异性结合,线性区间为0.2-4 ng/mL
ELISA

Immobilized Human CD133 Full Length, His Tag (Nanodisc) (Cat. No. CD3-H52H1) at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Human CD133 (133-3) Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.2-4 ng/mL (QC tested).

申请 Protocol

Q1:如何解读“膜杰作”?

"膜杰作"一方面是指平台,ACRO突破了技术难题,搭建了三大技术平台,为多次跨膜蛋白的成功研发提供了平台保障。另一方面,"膜杰作"是指ACRO依托于平台研发出的多次跨膜蛋白产品,具有全长、天然构象、稳定、高活性、覆盖多应用场景等杰出优势。 "杰",也是ACRO的"技术自信",以杰出的研发能力,服务于更好的生物医药。

Q2:想购买Claudin18.2做免疫和抗体筛选,怎么挑选?

我们制备的Claudin18.2有VLP平台下的版本,也有DDM/CHS平台下的Claudin18.2版本。两款都是可以的。不过免疫的话也可以优先选择VLP版本的,因为本身VLP可以提高免疫原性。筛选的话两款都是可以,如果想要得到准确的亲和力数据,推荐DDM/CHS版本(即去垢剂版本)。

Q3:抗体与抗原结合在胞外,全长的多次跨膜蛋白意义大吗?

多次跨膜蛋白在细胞膜上多次跨越,在胞外形成多个胞外区,比如Claudin18.2、CD20、CD133都有两个ECL(extracellular loops),每个ECL都有特定功能甚至会相互影响。全长可以保证蛋白构象天然完整,而且ECL展现完全,帮助筛选靶向多次跨膜蛋白抗原的理想抗体。给大家看下面两张图,全长的意义就显而易见了,结构完整,功能上也有保证。这么看,全长也不是我们ACRO一直在强调全长,而是客户需要全长的多次跨膜蛋白,满足客户需要的产品是ACRO的初衷。我们也比较过,单独的胞外ECL区蛋白活性确实比全长蛋白差。

多次跨膜蛋白就是要全长
Q4:VLP和Nanodisc平台下的多次跨膜蛋白怎么去除非特异抗体?

非特异抗体的影响不容忽视,使用VLP和Nanodisc平台下的膜蛋白的确可能产生非特异抗体,我们这两个平台均有对应的用于反筛去除非特异抗体的空白对照:VLP-膜蛋白有同型对照产品空白VLP;Nanodisc有两款MSP1D1空白产品,其中一款MSP1D1作为tag free 膜蛋白的同型对照,如果使用生物素化的Nanodisc-膜蛋白,另一款MSP1D1可以作为同型对照。

VLP/Nanodisc 同型对照产品
Q5:相比其他非Nanodisc产品,Nanodisc有什么好处吗?

Nanodisc-膜蛋白与去垢剂-膜蛋白相比,的确有不同。首先,原理上,Nanodisc膜蛋白是将膜蛋白除去去垢剂之后组装在类细胞膜的Nanodisc上。其次,应用上,我们都知道,去垢剂会溶膜从而对细胞产生损伤,Nanodisc版本的膜蛋白因不含去垢剂,可以进一步扩展到用于细胞试验、CAR阳性率检测,应用范围是更广的。另外,我们ACRO使用的Nanodisc技术已经获得专利持有方的授权,在研发过程中是可以放心使用的。

Q6:如何确认VLP-Claudin18.2表达的是该目标蛋白,纯度如何评估?产品上的电镜图片,怎么确认颗粒上有该蛋白?

Claudin18.2-VLP 我们会通过anti-Claudin18.2特异性的抗体进行检测验证。纯度我们通过电泳/HPLC/DLS电镜进行评估。常规负染电镜因分辨率低是没办法看到VLP上是否有Claudin18.2的。

Q7:VLP相关蛋白能适合冻干保存吗?VLP的用于免疫有什么注意事项?比如能否乳化,对佐剂类型有没有要求?

包膜VLP产品我们目前都是液体-70°C保存,干冰发货;非包膜VLP我们是冻干保存的。VLP免疫主要是需要注意佐剂量的选择,因为VLP本身是可以增强免疫原性的,跟常规蛋白不同。

Q8: CD24,PD-1等,也有VLP产品?和Claudin18.2是一样的吗?包膜VLP和非包膜有什么区别?

CD24,PD-1本身属于可溶蛋白,不是多次跨膜蛋白,所以使用的是非包膜的VLP;而多次跨膜蛋白因为有疏水跨膜区,所以需要使用包膜VLP;两者的区别就是VLP的表面是否有磷脂双分子膜。

Q9:VLP和Nanodisc产品稳定性如何。冷冻长时间保存可以吗?

VLP和Nanodisc本身的稳定性是很好的,是可以在-70°C长期保存的。

Q10:定制的全长多次跨膜蛋白,多久能到货?

定制的话,VLP版本的膜蛋白预计需要6-8周;DDM/CHS去垢剂版本的膜蛋白需要进行多次跨膜靶点蛋白表达纯化条件摸索和去垢剂筛选,所以开发周期更长一些,需要8周以上;Nanodisc版本的膜蛋白是DDM/CHS的周期上再加4周左右。

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相关参考文献

Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody rituximab.

The role of CD133 in cancer: a concise review.

  • Authors: Paige M. Glumac , Aaron M. LeBeau.

  • Journal: Glumac and LeBeau Clin Trans Med

  • Download Full Article

Structural and Molecular Interactions of CCR5 Inhibitors with CCR5.

  • Authors: Kenji Maeda, Debananda Das et al.

  • Journal: Journal of Biological Chemistry

  • Download Full Article

Role of Conserved Disulfide Bridges and Aromatic Residues in Extracellular Loop 2 of Chemokine Receptor CCR8 for Chemokine and Small Molecule Binding.

  • Authors: Line Barington, Pia C. Rummel, et al.

  • Journal: Journal of Biological Chemistry

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