2021年3月4日，来自南京传奇生物的蒋忻坡博士和ACROBiosystems的刘晶女士给大家分享了关于CAR-T质控研究的精彩内容，小编在这里汇总了直播过程中的Q&A，快来看看这其中有没有困扰你的CAR-T质控相关问题吧~
蒋忻坡博士
Q：请问如何进行磁珠残留方法验证?
A：最好的办法是让磁珠供应商来保证在整个流程中使用的磁珠的残留量是多少，若有磁珠残留，这个残留值是安全的。
Q：CAR-T作为个性化的细胞产品，仅通过标签进行溯源质控，是否严谨，有没有检测方法可以帮助确认？
A：实际上通过监管链（CoC）和供应链（CoI）就非常严谨，这是从源头到源头的追踪，如果说还不放心的话，可以使用STR验证下最开始病人的采样品和最终输进去的产品是不是匹配，但是监管链（CoC）和供应链（CoI）我觉得已经完全满足了。
Q：不同型号单采机，不同操作者对单采质量有影响吗？
A：会的，不同医院的单采血，在单采的细胞量和单采体积会有影响的，而且影响还是很大的。
Q：怎么降低CAR T产品的成本？
A：降低CAR-T成本的一个要点是原材料要国产化，比如慢病毒和磁珠是国产的还是进口的，价格是不一样的，还有生产慢病毒用的细胞如果是贴壁细胞，生产通量就很低，如果技术突破后能使用悬浮细胞，慢病毒的价格就会降下来；另外一个要点为使用的是自动化全封闭的还是手动的生产工艺，其中，进口的自动化全封闭管道是非常贵的，这会导致CAR-T价格相差极大。所以说从工艺和材料上都要加以评估，在保证产品安全的前提下，把价格降下来。
Q：一个CAR-T剂量需要多少滴度的病毒？
A：这要看慢病毒的MOI（感染复数），因为每个批次的滴度都是不一样的，做CAR-T转染的时候，还是建议测一下MOI，确定最终用的滴度量。不要认为是同一个生产厂商生产的慢病毒，就不做MOI，建议要测一下。
A：实际上使用慢病毒是最好的，因为它的转染效率最高。那怎样能达到较高病毒滴度呢？这要看慢病毒包装载体质粒是怎么设计的，比如启动子的设计，另外，同样的包装质粒和辅助质粒，送到不同的公司后有可能滴度是不一样的，所以说，一定要让生产慢病毒的公司做好验证，保证滴度是合格的
刘晶女士ACROBiosystems高级产品开发经理
Q：转导效率比较高，可是特异性杀伤很低，应该从哪些方面考虑呢？
A：主要从CAR-T结构设计上面去考虑，例如除了亲和力之外，还有内部的信号通路，可以去做一些优化，将增强杀伤功能的一些组件构建进去。比如 CD28或者4-1BB都是有各自功能的，CD28可以增强细胞杀伤活性，4-1BB可以延长存续时间，可以去做些这方面的优化，实现提高杀伤活性的作用。
Q：小鼠体内实验的话，外周血CAR 阳性率检测用流式比较好还是CAR基因拷贝数呢？
A：其实两种方式同时进行会比较理想的，不建议单独用一种方式去检测。基因拷贝数检测和流式检测可以会互为参照，这是从基因水平和蛋白水平分别做的检测。甚至也可以从mRNA水平上检测。因为CAR的基因表达是从基因水平转录成mRNA再翻译成蛋白，所以每个阶段都可以用相应的指标来说明CAR阳性率。
Q：FDA DMF备案产品和其他产品有什么差别？
A：FDA有一个备案制，比如，药物生产过程中使用的原材料，可将其工艺、质控标准等资料递交给FDA，如果申报临床的项目用到了这个原材料，当去FDA申报临床的时候，可引用该原材料的备案编号给FDA，FDA就可以直接查阅其信息。如果原材料没有FDA DMF备案，就需要跟原材料供应商索要相关资料，然后整合到递交临床申请的材料里面才能完成申报，所以对于DMF备案的产品是在申报过程中准备材料上面省力一些。
Q：对同一靶点的不同克隆号抗体检测结果是否有差异，需要验证吗？
A：需要的，因为我们之前也做ADA的抗体，检测了很多克隆号的抗体，发现不同克隆号抗体之间的亲和力有差异，所以肯定是需要验证的。
Q：流式结果显示，CAR阳性和阴性细胞分群不明显是什么原因？
A：主要有两方面原因，一方面是检测试剂的灵敏度不够高，另一方面是虽然转导进去了CAR基因，但并不是每个细胞的转导量都是一样的，导致一个细胞群里面出现表达量高、表达量低、表达量处于中间等不同状态的细胞，所以就可能会出现分群不是特别明显的情况。
A：抗独特型抗体是指针对抗体分子可变区上的特异抗原表位群的抗抗体。在CAR-T领域，其制备通常是将CAR的scFv作为免疫原免疫动物，经过筛选得到的一系列抗体。可分为有中和活性和没有中和活性的抗独特性抗体，都可以用在质控放行中，其中，中和活性的抗独特性抗体可特异性结合抗原识别表位；另外，在进行临床PK研究时，使用具有中和活性的抗独特性抗体，可以检测到游离的CAR-T细胞（指没有跟体内抗原结合的CAR-T细胞），而使用没有中和活性的抗独特性抗体，检测的是总的CAR-T细胞量（包括跟体内抗原结合和没有结合的CAR-T细胞）。
由于篇幅所限，小编就不在一一展示，更多关于CAR-T质控的Q&A、直播回放和演讲PPT（ACRO），扫描下方二维码入群即可得到~ACROBiosystems开发了一系列PE荧光定点标记的CAR-T靶点蛋白，具有高特异、高灵敏、高批间一致的特性，专门为FACS检测CAR表达而设计，保证CAR-T质控方法开发的稳定性和高效性。
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分子
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货号
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描述
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BCMA
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BCA-HP2H2
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PE-Labeled Human BCMA / TNFRSF17 Protein, His Tag (Site-specific conjugation)
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CD19
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CD9-HP2H3
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PE-Labeled Human CD19 (20-291) Protein, His Tag (Site-specific conjugation)
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Siglec-3
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CD3-HP2E3
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PE-Labeled Human Siglec-3 / CD33 Protein, His Avitag™ (Site-specific conjugation)
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SLAMF7
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SL7-HP2H3
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PE-Labeled Human SLAMF7 / CRACC / CD319 Protein, His Tag (Site-specific conjugation)
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FMC63
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FM3-HPY53
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PE-Labeled Monoclonal Anti-FMC63 scFv Antibody, Mouse IgG1 (Y45) (Site-specific conjugation)
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1e6 of the anti-CD19 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) of PE-Labeled Human CD19 (20-291), His Tag (Cat. No.CD9-HP2H3). PE Streptavidin was used as negative control (QC tested).
1e6 of the Anti-CD19 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) of PE-Labeled Monoclonal Anti-FMC63 scFv Antibody, Mouse IgG1 (Y45) (Cat. No.FM3-HPY53) and negative control antibody respectively, PE signal was used to evaluate the binding activity (QC tested).
1e6 of the Anti-BCMA CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) of PE-Labeled Human BCMA Protein, His Tag (Cat. No. BCA-HP2H2) and negative control protein respectively, PE signal was used to evaluate the binding activity (QC tested).
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膜杰作
Star Staining
