对于CAR-T细胞来说,发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞,CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的,因此,CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项,监管部门建议应采用流式细胞法(FACS)检测CAR转染阳性率。目前,针对CAR不同结构区域的检测方法,包括针对CAR抗原结合位点的,比如CD19抗原和抗独特型抗体,或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体、Protein L蛋白。➞文末可下载细胞治疗质量控制相关指导原则和政策解读相关文件哦~
那么,如何选择合适的CAR表达检测试剂呢?接下来,小编结合各种检测试剂的检测原理和优缺点,帮您选择出最合适的CAR表达检测试剂~
抗Fab抗体
抗 Fab 抗体可识别抗体Fab段,可与含有Fab段可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的(图1),具有一定的通用性,可检测不同靶点的CAR。商品化的抗 Fab 抗体产品质量参差不齐且多数为多抗,批间一致性较差。来自 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的多克隆山羊抗小鼠 F(ab)2 抗体是目前使用最广泛的抗Fab抗体,曾用于上市药物Yescarta 的抗 CD19 CAR表达检测[1]。
Protein L
图1 抗 Fab 抗体和protein L的CAR检测结合位点
抗Fab抗体和 Protein L具有相对便宜的价格,但它们都有明显的缺点:
染色前后需要严格洗涤,否则会与非 CAR的 IgG 样蛋白交叉反应而出现严重非特异;
做多色染色时,与其他抗体或FcX封闭试剂不兼容;
不能对双靶点CAR细胞上的单独CAR分别染色;
不能对合成的CAR进行检测。
靶抗原蛋白可与scFv特异性结合,因此可作为CAR表达检测试剂。例如可使用N 端靶抗原与 C 端 Fc片段(通常来自人 IgG1)融合的靶抗原-Fc嵌合蛋白(如CD19-Fc、HER2-Fc 和 PSCA-Fc),对 CAR-T 细胞进行染色,再使用荧光标记的抗 Fc抗体或链霉亲和素(若靶抗原-Fc 已被生物素化)进行二次染色,可完成对CAR的检测;另外,如果靶抗原-Fc已经带有荧光标记染料,对CAR-T细胞染色后可直接进行FACS检测,避免二次染色出现的非特异背景,同时还节约了一半的时间。
可与CAR特异性结合,具有CAR功能性验证作用;
可检测双靶点CAR-T细胞中单CAR的表达;
荧光标记的靶抗原蛋白,可一步染色完成检测CAR表达,减少非特异背景并节约时间;
还可用于激活 CAR-T 细胞;
价格相对Protein L等通用型检测试剂较贵。
抗独特型抗体可特异性结合CAR的scFv 可变区,具有较高的特异性和灵敏性。德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究团队开发的来自小鼠的抗 CD19 (FMC63) scFv单克隆抗独特型抗体(克隆 136.20.1),利用流式方法可特异性检测PBMC样本中的CD19 CAR表达,且灵敏度接近千分之一[2]。实际上,Anti-FMC63 scFv Antibody抗独特性抗体已被运用到多种临床前或临床阶段项目中[3]。
特异性结合CAR的scFv;
高特异性和高灵敏度,且非特异背景低,适用于检测临床样本;
具有中和活性的抗独特型抗体,可检测到游离的CAR阳性T细胞;
具有靶点专属性,开发周期长;
图2 靶点蛋白和抗独特型抗体分别检测CAR阳性率的原理
总体来看,Protein L、抗Fab抗体、靶抗原蛋白以及抗独特型抗体作为CAR表达检测试剂均有各自的优缺点,结合实际的应用情况,有以下几点建议供参考:
尽量不使用Protein L或抗Fab抗体,避免高非特异,导致实验结果不易分析;
抗体筛选、方法开发、质控等阶段建议选用抗原蛋白,保证筛选到的scFv具有功能性作用和质控方法的稳定性;
对于后期临床阶段来说,抗原蛋白为首选,来确保临床PK等药效学研究结果的可靠性,但对于临床样本,存在细胞组分比较复杂、CAR-T细胞含量较低等问题,导致CAR检测难度加大,因此,可选择灵敏度较高的抗独特型抗体检测临床样本。
我们提供CD19、BCMA、HER2、CD22、DLL3等50多种CAR-T靶点蛋白,涵盖Biotin、FITC、PE等多种标记类型,具有高特异、高灵敏、高批间一致的特性,经FACS验证适用于CAR表达检测。ACRO还开发了具有高特异性和高灵敏度的抗FMC63抗体,可高灵敏检测临床样本中的CD19(FMC63)CAR表达。
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PE标记CD19蛋白
可一步染色完成CD19 CAR表达检测
PE标记CD19蛋白
与未转染CAR的PBMC样本无结合
抗FMC63抗体
经FACS验证,可高灵敏检测CD19 CAR表达
抗FMC63抗体
经ELISA验证,具有中和活性,IC50 为0.084 μg/mL
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相关阅读:
参考文献:
[1] Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, Xu H, Black MA, Morgan RA, et al. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother. (2009) 32:689–702.
[2] Jena B, Maiti S, Huls H, Singh H, Lee DA, Champlin RE, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-specific monoclonal antibody to detect CD19-specific T cells in clinical trials. PLoS ONE. (2013) 8:e57838.
[3] Gomes-Silva D, Mukherjee M, Srinivasan M, Krenciute G, Dakhova O, Zheng Y, et al. Tonic 4-1BB costimulation in chimeric antigen receptors impedes T cell survival and is vector-dependent. Cell Rep. (2017) 21:17–26.
[4] Hu Y, Huang J. The Chimeric Antigen Receptor Detection Toolkit. Front Immunol. 2020;11:1770. Published 2020 Aug 11.
[5] https://ishare.ifeng.com/c/s/7xXSe4KmgTS