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【技术干货】您的CAR表达检测试剂选对了吗?

2021-07-29 13:11    浏览量:3408

对于CAR-T细胞来说,发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞,CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的,因此,CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项,监管部门建议应采用流式细胞法(FACS)检测CAR转染阳性率。目前,针对CAR不同结构区域的检测方法,包括针对CAR抗原结合位点的,比如CD19抗原和抗独特型抗体,或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体、Protein L蛋白。文末可下载细胞治疗质量控制相关指导原则和政策解读相关文件哦~

那么,如何选择合适的CAR表达检测试剂呢?接下来,小编结合各种检测试剂的检测原理和优缺点,帮您选择出最合适的CAR表达检测试剂~




通用型CAR检测试剂




1

抗Fab抗体

抗 Fab 抗体可识别抗体Fab段,可与含有Fab段可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的(图1),具有一定的通用性,可检测不同靶点的CAR。商品化的抗 Fab 抗体产品质量参差不齐且多数为多抗,批间一致性较差。来自 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的多克隆山羊抗小鼠 F(ab)2 抗体是目前使用最广泛的抗Fab抗体,曾用于上市药物Yescarta 的抗 CD19 CAR表达检测[1]

2

Protein L

是一种消化链球菌的表面蛋白,Protein L可识别抗体的Kappa轻链,可与含有Kappa可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的(图1),可用于检测人 VKI、VKIII、VKIV亚型和鼠VKI亚型的CAR,但不能检测人VκII亚型和鼠Ig的其他亚型的轻链。Protein L也具有一定的通用性,可检测不同靶点的CAR。需要注意的是,在Protein L 染色之前需要对细胞进行多次洗涤,严格去除血清或培养基中的残留免疫球蛋白,否则会出现严重的非特异背景。

图1 抗 Fab 抗体和protein L的CAR检测结合位点

要点

抗Fab抗体和 Protein L具有相对便宜的价格,但它们都有明显的缺点:

  • 染色前后需要严格洗涤,否则会与非 CAR的 IgG 样蛋白交叉反应而出现严重非特异;

  • 做多色染色时,与其他抗体或FcX封闭试剂不兼容;

  • 不能对双靶点CAR细胞上的单独CAR分别染色;

  • 不能对合成的CAR进行检测。





靶抗原蛋白




靶抗原蛋白可与scFv特异性结合,因此可作为CAR表达检测试剂。例如可使用N 端靶抗原与 C 端 Fc片段(通常来自人 IgG1)融合的靶抗原-Fc嵌合蛋白(如CD19-Fc、HER2-Fc 和 PSCA-Fc),对 CAR-T 细胞进行染色,再使用荧光标记的抗 Fc抗体或链霉亲和素(若靶抗原-Fc 已被生物素化)进行二次染色,可完成对CAR的检测;另外,如果靶抗原-Fc已经带有荧光标记染料,对CAR-T细胞染色后可直接进行FACS检测,避免二次染色出现的非特异背景,同时还节约了一半的时间。

要点

  • 可与CAR特异性结合,具有CAR功能性验证作用;

  • 可检测双靶点CAR-T细胞中单CAR的表达;

  • 荧光标记的靶抗原蛋白,可一步染色完成检测CAR表达,减少非特异背景并节约时间;

  • 还可用于激活 CAR-T 细胞;

  • 价格相对Protein L等通用型检测试剂较贵。




抗独特型抗体




抗独特型抗体可特异性结合CAR的scFv 可变区,具有较高的特异性和灵敏性。德克萨斯大学MD安德森癌症中心的研究团队开发的来自小鼠的抗 CD19 (FMC63) scFv单克隆抗独特型抗体(克隆 136.20.1),利用流式方法可特异性检测PBMC样本中的CD19 CAR表达,且灵敏度接近千分之一[2]实际上,Anti-FMC63 scFv Antibody抗独特性抗体已被运用到多种临床前或临床阶段项目中[3]

另外,抗独特型抗体分具有中和活性和无中和活性的抗独特性抗体,在进行临床PK研究时,使用具有中和活性的抗独特性抗体,可以检测到游离的CAR阳性T细胞(指没有跟体内抗原结合的CAR-T细胞),而使用没有中和活性的抗独特性抗体,检测的是总的CAR阳性T细胞量(包括跟体内肿瘤抗原结合和没有结合的CAR-T细胞)。
要点

  • 特异性结合CAR的scFv;

  • 高特异性和高灵敏度,且非特异背景低,适用于检测临床样本;

  • 具有中和活性的抗独特型抗体,可检测到游离的CAR阳性T细胞;

  • 具有靶点专属性,开发周期长;




图2 靶点蛋白和抗独特型抗体分别检测CAR阳性率的原理


总结

总体来看,Protein L、抗Fab抗体、靶抗原蛋白以及抗独特型抗体作为CAR表达检测试剂均有各自的优缺点,结合实际的应用情况,有以下几点建议供参考:

  1. 尽量不使用Protein L或抗Fab抗体,避免高非特异,导致实验结果不易分析;

  2. 抗体筛选、方法开发、质控等阶段建议选用抗原蛋白,保证筛选到的scFv具有功能性作用和质控方法的稳定性;

  3. 对于后期临床阶段来说,抗原蛋白为首选,来确保临床PK等药效学研究结果的可靠性,但对于临床样本,存在细胞组分比较复杂、CAR-T细胞含量较低等问题,导致CAR检测难度加大,因此,可选择灵敏度较高的抗独特型抗体检测临床样本。

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此外,我们的产品经PBMC批检放行,均显示与未转染CAR的PBMC样本无结合,高标准保证您的FACS检测信号来自靶抗原与CAR-T细胞的特异性结合,加速您的药物研发进程。




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验证数据


PE标记CD19蛋白


可一步染色完成CD19 CAR表达检测

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PE标记CD19蛋白


与未转染CAR的PBMC样本无结合

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抗FMC63抗体


经FACS验证,可高灵敏检测CD19 CAR表达

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抗FMC63抗体


经ELISA验证,具有中和活性,IC50 为0.084 μg/mL

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参考文献:

[1] Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, Xu H, Black MA, Morgan RA, et al. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother. (2009) 32:689–702.

[2] Jena B, Maiti S, Huls H, Singh H, Lee DA, Champlin RE, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-specic monoclonal antibody to detect CD19-specic T cells in clinical trials. PLoS ONE. (2013) 8:e57838.

[3] Gomes-Silva D, Mukherjee M, Srinivasan M, Krenciute G, Dakhova O, Zheng Y, et al. Tonic 4-1BB costimulation in chimeric antigen receptors impedes T cell survival and is vector-dependent. Cell Rep. (2017) 21:17–26.     

[4] Hu Y, Huang J. The Chimeric Antigen Receptor Detection Toolkit. Front Immunol. 2020;11:1770. Published 2020 Aug 11.

[5] https://ishare.ifeng.com/c/s/7xXSe4KmgTS



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