2021年7月29日，驯鹿医疗自主研发的全人源CD19/CD22双靶点CAR-T细胞注射液（研发代号：CT120）的两项临床试验（IND）申请，获得国家药品监督管理局药品审评中心的临床试验默示许可，适应症分别为: CD19/CD22阳性的复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）和复发/难治性急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）。CT120是全球首个进入临床阶段的全人源CD19/CD22双靶点自体CAR-T产品[1]。
图片来源：CDE官网
实际上，国内外已有不少公司/机构在研究CD19/CD22多靶点CAR-T疗法，国外主要有Autolus Therapeutics公司和斯坦福大学医学院，国内的恒润达生，亘喜生物、优卡迪生物、解放军总医院等也拥有基于这一策略上的候选产品。那么，为何多靶点的CAR-T疗法会受到行业内多家企业的热捧？一个重要的原因是它可以有效防止肿瘤细胞免疫逃避。以CD19靶点为例，研究表明，CD19并不是CAR-T细胞针对B细胞恶性肿瘤的唯一有效靶标，除它之外，还存在CD20、CD22、CD123等众多靶点。在临床治疗时，一些原本表达CD19的癌细胞会在CD19 CAR-T疗法的压力下，导致CD19阴性（丢失）或者转而表达其他类型的B细胞恶性肿瘤靶标蛋白，而双靶点的CAR-T细胞疗法能够双管齐下，在靶向CD19的同时，选择性地靶向另外一个B细胞恶性肿瘤靶标，这样即便癌细胞产生了逃避机制，这款疗法也能及时调转目标，对癌细胞进行持续攻击[2]。
图1 肿瘤细胞逃避CAR-T杀伤的机制
这种同时覆盖多个靶抗原并且有多个T细胞刺激通道的多靶点CAR-T细胞药物已在临床治疗中表现出良好的疗效。目前多靶点CAR-T在结构设计上各有不同，主要有以下几种设计策略。
1、Dual CAR：是一种通过双顺反子表达载体在同一个细胞表面表达两种CAR，并具有各自独立的信号传导途径的CAR-T细胞类型，报道显示，Dual CAR被其中一种抗原识别时，信号传导强度相当于正常的T细胞激活，而当两种靶抗原同时识别时，可展现出最大的信号转导强度（通过检测ZAP-70激酶的磷酸化水平）。另外由于肿瘤细胞表面的靶抗原和CAR-T细胞表面的CAR两者之间的密度平衡与CAR-T细胞的应答强度密切相关，使得高密度表达CAR的Dual CAR-T在杀伤具有高密度靶抗原的肿瘤细胞时独具优势[3]。
2、Tandem CAR：指在同一表达载体上串联表达两种CAR的T细胞，且只有一个共同的信号传导途径，任意一种靶抗原刺激时均可引起T细胞的激活，其中当两种靶抗原同时识别Tandem CAR时形成的二价免疫突触，可以有效阻止肿瘤表面抗原逃避并提升抗肿瘤活性[4]。值得注意的是，来自两种不同scFv的VH和VL之间的交叉重组、病毒包装载体的大小以及鼠源scFv引起的机体排斥等原因均影响Tandem CAR的开发难度[5]。
3、Trivalent CAR：指在单个T细胞表面同时表达三个CAR，并具有各自独立的信号传导途径的CAR-T细胞。来自Meenakshi课题组的研究人员发现[3]，胶质母细胞瘤（GBM）患者的肿瘤微环境非常的复杂，主要表现为肿瘤细胞异质性高和血脑屏障通透性低等特征，并且会出现特定的靶抗原对变异，即使采用Dual CAR也无法覆盖足够的靶抗原。因此他们针对GBM患者开发了三价的CAR-T细胞（同时靶向HER2、IL13Rα2和EphA2），最终癌细胞的清除率接近100%。Trivalent CAR之所以具有如此强大抗肿瘤活性，是由于可以覆盖多个靶抗原并具备三条信号转导通路可高强度激活T细胞，以及Trivalent CAR与靶抗原结合时形成的三价免疫突触提高了抗肿瘤活性。
图2 三种多靶向CAR的设计策略[6]
尽管多项研究数据显示，多靶向CAR-T治疗多种恶性肿瘤的疗效显示积极，成为预防抗原逃避的有效手段，但这种类型的CAR-T细胞可被多个靶抗原识别并高强度激活T细胞，容易引起细胞因子风暴，并对低表达靶抗原的正常细胞过度杀伤，因此需要在结构设计和功能上进一步的优化，在确保安全的情况下有效发挥肿瘤杀伤作用。另外，在CAR-T细胞的开发过程中，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，但对于多靶点CAR-T而言，需要检测2-3个CAR的表达，相比于单CAR而言，多CAR的检测难度加大，目前，主流的检测方案是对两种CAR分别染色，再使用不同的二抗染色，容易出现非特异背景强、两种CAR不易区分等问题。
为解决多靶点CAR检测难题，ACRO利用专业的蛋白研发平台、荧光定点标记平台和流式细胞分析平台，开发了一系列高批间一致性的FITC标记和PE标记等荧光标记蛋白，包括CD19、CD22、CD33、CLL-1、BCMA等多种CAR-T靶点蛋白，您可以灵活搭配使用，一步染色即可实现高特异、无背景检测双/多CAR的表达。
此外，我们的产品经PBMC批检放行，均显示与未转染CAR的PBMC样本无结合，高标准保证您的FACS检测信号来自靶抗原与CAR-T细胞的特异性结合，加速您的药物研发进程。
参考文献
[1] http://en.iasobio.com/news/35.html
[2] http://www.cancer123.com/news/2020070912182.html
[3] Hegde M, Corder A, Chow KK, et al. Combinational targeting offsets antigen escape and enhances effector functions of adoptively transferred T cells in glioblastoma. Mol Ther. 2013;21(11):2087-2101.
[4] Hegde M, Mukherjee M, Grada Z, et al. Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Rα2 mitigate tumor antigen escape. J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052.
[5] Jensen MC, Riddell SR. Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells. Immunol Rev. 2014;257(1):127-144.
[6] Han X, Wang Y, Wei J, Han W. Multi-antigen-targeted chimeric antigen receptor T cells for cancer therapy. J Hematol Oncol. 2019;12(1):128.
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