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【前沿进展】屡次摘获诺贝尔奖,膜蛋白的能量超乎想象

2021-10-13 09:49    浏览量:3160

前情提要


2021年10月4日,备受瞩目的诺贝尔生理学或医学奖终于揭晓,颁发给了David Julius和Ardem Patapoutian,以表彰他们发现了温度感知和触觉受体 (Transient receptor potential ion channel),揭示我们感知世界的奥秘。

回首2012年,Robert J. Lefkowitz和Brian K. Kobilka因“G蛋白偶联受体研究”获得了诺贝尔化学奖。2003年,Peter Agre与Roderick Mackinnon因离子通道的研究获得了诺贝尔化学奖。这三次诺贝尔奖,巧合的是它们都间隔了9年,都垂青于膜蛋白研究。

膜蛋白作为主要的生理传感器,涵盖了视觉、嗅觉、温度和压力感知等众多受体,涉及生理过程范围之广,以及在科学界所受关注度之高,使其成为了药物开发领域的重要靶点。





目前上市的所有药物中有50%以上是由人类膜蛋白组成的。GPCRs(G-protein coupled receptors,G蛋白偶联受体)是人体中最大的膜蛋白家族。

接下来,小编将重点为您介绍GPCRs的结构、信号通路、靶向药物各阶段的开发格局。ACROBiosystems突破GPCRs抗原制备难点,可提供全长GPCRs抗原,助力抗体开发,值得推荐。






GPCRs结构


GPCRs的共同分子结构由7个跨膜α螺旋组成,这些结构域将受体分割为胞外N端,胞内C端,3个胞外环和3个胞内环。胞外环上包含有两个高度保守的半胱氨酸残基,它们可以通过形成二硫键稳定受体的空间结构。胞内环上有G蛋白结合位点。以CCR5为例,经典的GPCRs拓扑结构如下图所示1

图1. 经典的GPCRs拓扑结构示意图1






GPCRs的信号机制


G蛋白是在信号转导过程中,与GPCRs偶联并能与鸟苷酸结合的一类蛋白,位于细胞膜胞质内,由α、β和γ三种亚单位组成的三聚体。G蛋白主要功能是通过自身构象的变化激活效应蛋白,进而实现信号由胞外向胞内的传递。在静息状态下,GPCRs不结合配体,胞质中的αβγ三聚体与GDP (Guanosine diphosphate) 结合,并与受体分离,无活性。当配体与GPCRs结合,GPCRs与G蛋白α亚基结合的位点暴露,并与之相互作用,导致α亚基构象改变,与GDP亲和力减弱,与GTP (Guanosine triphosphate) 亲和力增强。此时GDP-αβγ复合物在Mg2+参与下,结合的GDP与胞质中GTP交换,形成GTP-αβγ复合物。随后G蛋白被激活,并与受体分离,同时解体为GTP-α与βγ两部分,这两个分子沿着细胞膜自由扩散,直接与细胞膜下游的效应蛋白作用,导致效应体激活和启动第二信使级联,完成信号从胞外传递到胞内。当配体与受体结合解除后,α亚单位本身具有GTP酶活性,能促使GTP水解为GDP,再与βγ亚单位形成G蛋白三聚体恢复原来的静息状态。G蛋白下游信号蛋白通常是离子通道或与膜结合的酶,通常为腺苷酸环化酶和磷脂酶C等2

图2:GPCRs信号通路2

GPCRs存在于体内所有的细胞中,能偶联多种配体,包括离子、神经递质、糖类、脂质、内源性多肽、蛋白酶等生物大分子,通过激活G蛋白和其他信号分子参与众多生理过程,包括肌肉收缩和松弛、神经信号传递、免疫系统调节及机体整体代谢等。GPCRs也是人体内最大的成药家族,涉及的疾病主要包括肿瘤、自身免疫、神经系统疾病、心血管疾病等,因此,GPCRs是治疗多种疾病的优秀的药物靶点。






靶向GPCRs药物开发进展


GPCRs作为药理学靶点一直备受关注。2011-2015年,针对GPCRs的药物总销售额约为8900亿美元,占全球治疗药物市场份额的27%。GPCRs中除了大约一半的嗅觉受体外,尚有227种(57%)非嗅觉受体处于未开发状态,仍具有广泛治疗潜力,特别是在遗传和免疫系统疾病方面

2017年,有调查数据显示,以GPCRs为靶点的治疗药物有481种,约占FDA批准的所有药物的34%,共涉及107个独特的GPCRs。其中大约有320种药物正在进行临床试验,约35%的药物靶向64个潜在的新GPCRs靶点3

在以GPCRs为靶点的药物开发领域中,GPCRs抗体相对于小分子药物具有独特的优势:

  • · 体内的清除率更低,作用时间更长,相应的给药频率更低;

  • · 抗体的选择性明显优于小分子;

  • · 由于血脑屏障的阻隔,抗体药物无法进入中枢神经,因此对于在外周和中枢神经系统均有表达的GPCRs,若只需针对外周的部分设计药物,则可以开发治疗性抗体,使药物主要分布在外周区域,降低对中枢神经系统的毒副作用

图3:GPCRs临床药物靶点分布3


目前全球范围内处于活跃状态的GPCRs靶向抗体大约有14个,靶点分别是CCR4、CGRPR、CCR5、GCGR、GPRC5D、GLP1R、C5AR、CB1、S1PR1、CCR8、CCR7、GPR49、AGTR1。比较有代表性的药物是Leronlimab,一种靶向CCR5的人源化IgG4单克隆抗体,是一种HIV病毒进入抑制剂。通过掩盖CCR5,阻断HIV(R5)亚型进入健康T细胞,从而保护这些细胞免受病毒感染。

靶向GPCRs药物信息(Clarivate数据库)


图片

ACROBiosystems助力靶向GPCRs抗体开发


制备抗体的第一步就是抗原免疫,而免疫的第一步就是抗原的制备。由于GPCRs类靶点胞外露出部分有限、细胞表面表达低、蛋白聚集等因素,导致想要获得具有生物学活性的可溶性GPCRs抗原极其困难,这也成为了GPCRs药物研发的瓶颈。要获得全长天然的GPCRs抗原用于药物研发,则需要突破两个瓶颈:

  • · 表达量的提升。大部分膜蛋白在细胞膜上的表达量非常小,有的甚至是仅在细胞周期的某个短时间内表达。同时,不同于分泌型蛋白,膜蛋白的表达和展示受限于膜面积,另外,由于很多膜蛋白涉及到物质转运和信号传递相关的功能,其在细胞膜上过量表达会对细胞造成不可逆的伤害,膜蛋白的这些特性极大地限制了其表达量。因此,要获得足量的用于免疫和药物研发的全长膜蛋白,需要在表达区间、表达体系、培养条件等多方面进行设计和优化,即便如此,获得毫克级的膜蛋白的成本仍然远远高于可溶蛋白。

  • · 在表达和纯化的过程中保持膜蛋白的均一性和活性。膜蛋白的跨膜结构域是高度疏水的,因此无保护的暴露在水环境下将导致非特异性蛋白聚集甚至变性,因此,在针对膜蛋白的富集和纯化的过程中,需要始终维持膜蛋白周围环境的亲疏水特性。目前常用的方法是通过去垢剂4将膜蛋白从磷脂双分子层细胞膜上抽提出来,并形成胶束,以尽可能保持其天然构象和功能活性,同时也有诸如构建纳米盘(Nanodiscs)5、病毒样颗粒(Virus-like particles, VLP)6、聚合物脂质颗粒(polymer lipid particle, PoLiPa)7等方法用于膜蛋白的重构和功能研究。


为助力靶向GPCRs药物研究,ACROBiosystems专门搭建了VLP、膜蛋白-去垢剂、Nanodisc平台化解决方案,提供全长GPCRs蛋白,如GPRC5DCCR5CCR8等,可用于免疫、ELISA、SPR、BLI等场景。

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除GPCRs之外,ACROBiosystems可以提供种类齐全的全长多次跨膜蛋白,包括四次跨膜蛋白CD20Claudin18.2,五次跨膜蛋白CD133,更多全长蛋白正在开发中,敬请关注和咨询。

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参考文献

1. Dong HF, Wigmore K, Carrington MN, Dean M, Turpin JA, Howard OM. Variants of CCR5, which are permissive for HIV-1 infection, show distinct functional responses to CCL3, CCL4 and CCL5. Genes Immun. 2005 Oct;6(7):609-19. doi: 10.1038/sj.gene.6364247. PMID: 16015368; PMCID: PMC1369982.

2. Hanlon CD, Andrew DJ. Outside-in signaling--a brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. J Cell Sci. 2015 Oct 1;128(19):3533-42. doi: 10.1242/jcs.175158. Epub 2015 Sep 7. PMID: 26345366; PMCID: PMC4610211.

3. Hauser AS, Attwood MM, Rask-Andersen M, Schiöth HB, Gloriam DE. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat Rev Drug Discov. 2017 Dec;16(12):829-842. doi: 10.1038/nrd.2017.178. Epub 2017 Oct 27. PMID: 29075003; PMCID: PMC6882681.

4. Wiseman DN, Otchere A, Patel JH, Uddin R, Pollock NL, Routledge SJ, Rothnie AJ, Slack C, Poyner DR, Bill RM, Goddard AD. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: A review. Protein Expr Purif. 2020 Mar;167:105524. doi: 10.1016/j.pep.2019.105524. Epub 2019 Oct 31. PMID: 31678667; PMCID: PMC6983937.

5. McLean MA, Gregory MC, Sligar SG. Nanodiscs: A Controlled Bilayer Surface for the Study of Membrane Proteins. Annu Rev Biophys. 2018 May 20;47:107-124. doi: 10.1146/annurev-biophys-070816-033620. Epub 2018 Mar 1. PMID: 29494254; PMCID: PMC6370528.

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7. Hothersall JD, Jones AY, Dafforn TR, Perrior T, Chapman KL. Releasing the technical 'shackles' on GPCR drug discovery: opportunities enabled by detergent-free polymer lipid particle (PoLiPa) purification. Drug Discov Today. 2020 Aug 21:S1359-6446(20)30337-8. doi: 10.1016/j.drudis.2020.08.006. Epub ahead of print. PMID: 32835806.

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