【新冠专栏】新冠S蛋白不可忽视的糖基化修饰问题

蛋白质糖基化是生物体内最重要的翻译后修饰形式之一，可发生在细胞中50%-70%的蛋白质上。糖基化参与调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能和活性，会影响细胞识别、细胞分化、信号转导、免疫应答等多种重要的生命活动，糖基化异常可导致肿瘤、免疫性疾病、代谢性疾病和神经退行性疾病等多种病症。对于病毒，其自身结构蛋白的糖基化修饰与病毒生成、病毒感染和机体免疫应答均有密切关系。

2020年3月25日，在上海市科委发起主办的“科技战疫在线国际研讨会”上，牛津大学糖生物学研究所所长Raymond Dwek教授认为，新型冠状病毒的高度糖基化现象将给新冠疫苗的研发带来极大困难。此外，近期在预印版bioRxiv平台上刊登了多篇鉴定新型冠状病毒S蛋白糖基化位点及糖链类型的研究论文^1-4。由此可见，新冠病毒的糖基化问题引发基础科研领域和制药工业界的广泛关注。

接下来让我们看看3篇关于新冠病毒S蛋白糖基化的研究都有哪些新发现。

第1篇

2020年3月26日，英国南安普顿大学与美国德克萨斯大学奥斯汀分校合作在bioRxiv发表论文¹：研究人员利用293F细胞重组表达了新冠病毒S蛋白，然后分别用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和A裂解蛋白酶将S蛋白酶解成肽段，通过质谱方法鉴定出S蛋白单体上的22个N-糖基化位点（图1），其中18个糖基化位点在SARS病毒S蛋白中是保守的。

图1. 新冠病毒S蛋白N-糖基化位点图示

通过分析，研究人员发现S蛋白糖基化位点的糖链修饰包括高甘露糖型、杂合型和复合型共三种糖链类型，其中复合型糖链占比较高，不同糖基化位点的多糖种类和丰度具有较大差别（图2）。

图2. 新冠病毒S蛋白N-糖基化修饰的多糖类型及组成

第2篇

2020年3月28日，中国四川大学华西医院在bioRxiv发表论文²：研究人员对商业化出售的新冠S蛋白（昆虫细胞表达）和S1蛋白（293细胞表达）的位点特异性N-糖基化进行特征分析，与前述论文的研究方法类似，研究人员分别使用胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶处理S蛋白和S1蛋白样品，然后利用Zic-HILIC富集酶解片段，并用阶梯能量HCD碎裂的质谱分析方法鉴定新冠病毒S蛋白的N-糖基化图谱（图3）。

图3. 新冠病毒S蛋白N-糖基化图谱鉴定操作流程

与前述论文的结果一致，研究人员在由昆虫细胞表达的S蛋白上鉴定出相同的22个N-糖基化位点，但其糖链修饰主要是高甘露糖型，共含有38种多糖，而293细胞表达的S1蛋白的糖链修饰主要为复合型糖链，含有多达140种多糖。这说明使用昆虫细胞和293细胞表达的S蛋白，其糖链修饰类型和多糖组成的差异极大（图4）。

图4. 昆虫细胞与293细胞表达出的新冠病毒S蛋白的N-糖基化差异（上：昆虫细胞表达的S蛋白N糖基化类型；下：293细胞表达的S1蛋白N糖基化类型）

第3篇

2020年4月1日，美国佐治亚大学在bioRxiv上发表论文³：实验人员使用293细胞分别表达新冠病毒S蛋白的S1亚基和S2亚基，然后利用胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化蛋白样品，并通过质谱方法对蛋白糖基化图谱进行鉴定。他们在S蛋白22个潜在N-糖基化位点中发现17个有糖基化修饰，糖基化类型主要为高甘露糖型和复合型，没有杂合型，而其余5个潜在N-糖基化位点并没有发现糖基化修饰(图5)。此外研究人员还在S1蛋白的RBD区域鉴定出2个O-糖基化位点（O323/O325）。

图5. 新冠病毒S蛋白N-糖基化及O-糖基化位点及糖链类型展示

以上3篇论文均通过质谱方法对体外重组表达的新冠病毒S蛋白的糖基化位点和糖链类型进行了全面分析。由于昆虫细胞和293细胞的糖链修饰系统存在较大差异，因此昆虫细胞和293细胞表达出的S蛋白的糖链类型和多糖组成有明显区别。值得注意的是，同样是用293细胞表达体系，3篇论文中S蛋白的糖基化水平和糖链种类也有很大差别，说明重组S蛋白的糖基化修饰具有多样性和异质性，应引起新冠预防和治疗药物研发企业以及新冠抗体检测公司的重视。

1）疫苗研发：目前针对新型冠状病毒的疫苗研发进展迅速，已有三款疫苗进入临床试验阶段，另有几十款疫苗也在加紧推进临床前研究。其中三叶草生物制药（Clover Biopharmaceuticals）选择将新冠病毒S蛋白的三聚体形式作为亚单位重组疫苗，通过哺乳动物细胞大量快速表达生产此疫苗组分。但鉴于糖基化修饰对S蛋白的重要性以及S蛋白糖链修饰的多样性，相关疫苗企业应对三聚体S蛋白进行糖基化图谱鉴定，确保不同生产批次的蛋白糖基化类型一致，以保证疫苗的安全性、稳定性及免疫原性。

2）治疗药物开发：有研究表明，阻断ACE2（新冠及SARS病毒侵染细胞的受体）的糖基化不会影响ACE2在宿主细胞上的表达水平以及与SARS S蛋白的结合力，但是会降低SARS病毒入侵宿主细胞的能力⁵。新冠病毒与SARS病毒一样，都是以ACE2为受体侵染宿主细胞，因此ACE2的糖基化差异可能也会影响新冠病毒的感染能力。鉴于阻断新冠病毒S蛋白与其受体ACE2的结合是药物研发的重要方向，相关研发人员应使用能模拟蛋白真实糖基化水平的表达系统，即用哺乳动物细胞表达的新冠S蛋白和ACE2蛋白进行药物筛选。但目前即使是发表在高水平杂志上的论文⁶，其使用的新冠S-RBD与ACE2的蛋白样品均由昆虫细胞表达，这可能会影响实验结果的准确性和真实性。

3）检测试剂盒生产：因为新冠病毒S蛋白的糖基化水平有可能会对抗体检测的灵敏度和特异性产生影响⁷，市场上的新冠IgG/IgM抗体检测试剂盒的生产商应在其产品中使用接近病毒天然状态下的抗原蛋白（由哺乳动物细胞表达的新冠病毒S或S1蛋白）为检测原料⁵，以提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，提升抗体检测的准确率。

我们对HEK293和Insect Cells表达的SARS-CoV-2 S蛋白进行了纯度与活性的验证。

产品名称：SARS-CoV-2 (COVID-19) S protein (R683A, R685A), His Tag, active trimer (HEK293)

货号：SPN-C52H8

HEK293细胞表达的S蛋白经SEC-MALS验证为三聚体，纯度高达85%，分子量约为600-660KDa。（红色线）

Insect细胞表达的S蛋白经SEC-MALS验证呈现为高聚状态。（蓝色线）

ELISA测定HEK293细胞和Insect细胞表达的S蛋白与ACE2蛋白结合的EC50分别为0.23nM与0.67nM。

数据表明，不同表达系统（HEK293和Insect）表达的SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2蛋白的结合活性有差异，可能是因为不同表达宿主的糖链修饰系统存在较大差异，从而影响了蛋白的结合活性。

ACROBiosystems基于HEK293的人源细胞表达平台开发出了具有天然糖基化水平的S，S1，S-RBD及ACE2等蛋白，蛋白产品经过SPR、ELISA等方法确认了其结合活性，可用于疫苗研发、治疗药物开发、检测试剂盒生产等各大领域。

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