低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）的升高是导致高血脂的“元凶”之一， 它的含量可以反映血浆中运输内源性胆固醇的主要载体——低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein, LDL)的水平。肝细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）可以与LDL结合形成 LDL-R-LDL 复合物从而降解LDL-C，之后 LDLR 再循环回到细胞表面。
前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）是一种参与LDLR生命周期的分泌性蛋白，通过促进LDLR降解来调节血浆LDL-C 水平。PCSK9 是LDLR的主要下调因子：PCSK9 与 LDLR 的胞外结构域结合产生了一种复合物，该复合物易位至内体，其中酸性 pH 增强了 PCSK9 与 LDLR 的结合亲和力，使LDLR在溶酶体中的降解增强，防止 LDLR 再循环到细胞膜，进而引起循环LDL-C水平增高。
Figure.1：ScienceDirect
目前，越来越多的企业看好PCSK9靶向药市场，并开发出多款在研药物。以单抗为主，此外还包括小分子药物、siRNA反义寡核苷酸疗法、环肽类药物药物和抑制循环 PCSK9 活性的 PCSK9 疫苗等，基因编辑技术直接修改 PCSK9 基因以实现一劳永逸的预防心血管疾病也在进一步研究当中。
Figure.2 A: Strategiestargeting PCSK9. PCSK9 activity can be inhibited at several levels. B: PCSK9 function and potential targets forinhibition.
2015年7月、8月，FDA分别批准了赛诺菲／再生元联合开发的Alirocumab（阿利西尤单抗）以及安进开发的Evolocumab（依洛尤单抗）两款单抗类产品，可阻断循环PCSK9蛋白和LDLR之间的相互作用。
Lerodalcibep一种由Lib Therapeutics公司开发的含PCSK9结合域和人血清白蛋白的重组融合蛋白，可将其半衰期延长至12-15天，目前正处于Ⅲ期临床试验阶段，显示出了较好的疗效。由于作用机制明确，PCSK9单抗也成为国内药企追捧的领域。Tafolecimab是信达生物自主研发的一种用于治疗高胆固醇血症的抗PCSK9重组全人源单克隆抗体，临床研究结果显示：该药具有良好的安全性、耐受性及疗效，所有接受Tafolecimab给药的健康受试者和高胆固醇血症受试者中LDL-C均发生降低，而且展现了更长时间的给药间隔。昂戈瑞西单抗（JS002）是君实生物开发的一款重组人源化抗PCSK9单抗，拟开发用于治疗原发性高胆固醇血症和混合型高脂血症。已完成的I期和II期临床研究结果显示：该药良好的安全性和耐受性特征，而且降脂疗效显著。
尽管破坏 PCSK9-LDLR 结合的治疗性抗体/抑制剂可降低 LDL-C 浓度和心血管疾病风险是目前基于PCSK9靶点的主流开发策略。但是，LDLR 的表皮生长因子前体同源结构域 A (EGF-A) 通过平面界面与 PCSK9主要接触对识别小分子 PCSK9-LDLR 干扰物的筛选提出了挑战。
诺华公司创新开发基于亲和力筛选方案，基于Peptide Discovery Platform System (PDPS) 技术平台，研究人员使用生物素化PCSK9 蛋白偶联磁珠，对大环肽分子进行筛选：从包含 > 1013 个独特肽的初始库中，链霉亲和素磁珠富集了 PCSK9 特异性结合剂，最终通过多次复筛并配合二代测序技术发现小分子抑制剂13PCSK9i；进一小鼠动物模型验证发现随13PCSK9i剂量增加，降低血浆胆固醇水平并增加肝脏 LDLR 密度。13PCSK9i 通过独特的变构机制发挥作用，是迄今为止鉴定的具有体内 PCSK9-LDLR 阻断功能的最小分子，其分子量约为常规抗体的1/100此外，通过对初始文库筛选，发现特异性PCSK9识别高亲和力配体。这些配体利用独特的诱导贴合口袋并部分破坏 PCSK9-LDLR 相互作用。基于此结构的设计的分子具有增强的功能和药代动力学特性。这一系列研究成果为动脉粥样硬化新类型小分子抑制剂开发提供新的开发方向 [2]。
Figure. 3
13PCSK9i functions by a distinct, allosteric mechanism and is the smallest molecule identified to date with in vivo PCSK9-LDLR disruptor function.
Inclisiran是一种由阿斯利康开发的靶向PCSK9的双链小干扰RNA（siRNA），其可以通过特异性地降解PCSK9 mRNA来抑制翻译，减少PCSK9蛋白的合成，从而降低血浆LDL-C水平。研究显示，Inclisiran可使血浆中LDL-C水平降低50%，且拥有半年一次给药潜力，是当之无愧的明星药。该药目前已获得欧洲药品管理局和美国FDA的批准。
AZD8233是阿斯利康和Ionis合作而获得的一款PCSK9靶向反义寡核苷酸（ASO）药物，用于靶向抑制肝细胞内PCSK9 mRNA的翻译和蛋白合成。I期临床试验结果显示，单剂AZD8233皮下注射可实现PCSK9水平降低超 90％，LDL-C 水平降低 70％。2021年12 月 16 日， AZD8233 首次在国内递交临床申请。
MK-0616是一种可通过消化道吸收的合成的小分子环状肽类，能阻断PCSK9蛋白和LDLR的结合。临床试验结果显示：MK-0616在高胆固醇患者中的耐受性良好，剂量达300毫克，没有死亡或严重副作用。在一项多剂量研究中，在当前他汀类药物治疗的基础上服用MK-0616的患者，LDL-C比基线水平降低了约65%。
CRISPR单碱基编辑技术是一种正处在动物实验阶段的降脂疗法。研究显示，在非人类灵长类动物中，单次输注被PCSK9信使RNA包围的脂质纳米颗粒，可有效降低PCSK9蛋白和LDL-C水平，且只有低水平的脱靶编辑。更多替代治疗（如锌指核酸酶、CRISPR-Cas9核酸酶）的研究正在进行中，还需要进一步评估脱靶编辑水平和长期安全性。
>>>点击了解：CRISPR-Cas系列蛋白
总结：
PCSK9越来越受到各药企的青睐，随着研究的深入，除了降血脂，PCSK9靶向药还有望用于治疗糖尿病、非酒精性脂肪肝等代谢性疾病，以及与代谢密切相关的疾病如阿尔兹海默病、肿瘤等。
ACROBiosystems开发了一系列PCSK9相关蛋白用于动脉粥样硬化等相关研究。
产品覆盖多种属、多标签，覆盖D374Y、R194A等突变位点
高纯度：经SDS-PAGE验证纯度＞95%；经SEC-MALS验证纯度＞90%
高生物活性：经ELISA/SPR/BLI/FACS验证，免费提供 Protocol
生物素化的产品可以满足抗体/小分子抑制剂创新筛选应用方案需求
除了重组蛋白相关以外，ACROBiosystems 基于其独特的生物素标记蛋白产品，开发了PCSK9抑制剂筛选试剂盒（PCSK9 [Biotinylated] : LDL R Inhibitor Screening ELISA Assay Pair），用于对Human PCSK9 与human LDL R 结合的抑制剂进行快速高通量筛选。
>>>均一结构及纯度经MALS验证
The purity of Human PCSK9, His Tag (Cat. No. PC9-H5223) is more than 90% and the molecular weight of this protein is around 70-80 kDa verified by SEC-MALS.
>>>高生物活性经ELISA验证
Immobilized Human PCSK9, His Tag (Cat. No. PC9-H5223) at 2 μg/mL (100 μL/well) on an Nickel Coated plate can bind Human PCSK9 Mab (RN316), Human IgG1 with a linear range of 0.2-3 ng/mL (Routinely tested).
Immobilized Human LDL R, His Tag (Cat. No. LDR-H5224) at 10 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human PCSK9, Avitag,His Tag (Cat. No. PC9-H82E7) with a linear range of 8-63 ng/mL (QC tested).
>>>高生物活性经BLI验证
Loaded Human LDL R, Fc Tag (Cat. No. LDR-H5254) on Protein A Biosensor, can bind Cynomolgus PCSK9, His Tag (Cat. No. PC9-C5223) with an affinity constant of 1.46 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e) (Routinely tested).
>>>高生物活性经FACS验证
FACS analysis shows that the effect of Human PCSK9 (D374Y), His Tag (Cat. No. PCY-H5225) inhibiting LDL uptake in HepG2 cells was neutralized by Anti-Human PCSK9 antibody. The concentration of PCSK9 used is 5 μg/mL. The EC50 for Anti-Human.
★PCSK9 [Biotinylated] : LDL R抑制剂筛选试剂盒（货号：EP-103）
PCSK9 [BIOTINYLATED]: LDL R BINDING IN THE ABSENCE OF INHIBITORS
Immobilized human LDL R protein at 3 μg/mL (100 μL/well) can bind biotinylated human PCSK9 with a linear range of 0.000625-0.02 μg/mL when detected by Streptavidin-HRP. Background was subtracted from data points before curve fitting (QC tested).
INHIBITION OF PCSK9 [BIOTINYLATED]: LDL R BINDING BY ANTI-PCSK9 NEUTRALIZING ANTIBODY
Serial dilutions of anti-PCSK9 neutralizing antibody (Catalog # PC9-NA003) (1:2 serial dilutions, from 20 μg/mL to 0.04 μg/mL or 133.33 nM to 0.26 nM) were added into Biotinylated PCSK9: LDL R binding reactions. Background was subtracted from data points prior to log transformation and curve fitting (QC tested).
PC9-H82E7: Biotinylated Human PCSK9 Protein, Avitag™,His Tag (MALS verified)，我们主要使用此抗原来进行ELISA实验，在方法开发阶段使用FC标签的pcsk9包被无果后，购买了此款生物素标记的pcsk9抗原，在提前包被SA后，再进行此抗原包被，成功完成本实验，解决了我们实验过程中包被抗原的难题。
原来还可以借助生物素-链霉亲和素系统的强结合能力来解决问题！不过，自己铺板的时候也要注意手法哦，否则也会有铺板不均匀的情况存在。
作为您实验路上值得信赖的伙伴，ACROBiosystems也推荐您使用我们的链霉亲和素预包被96孔板（Cat.No. SP-11），利用生物素-链霉亲和素系统的高特异性和高灵敏度特性，可将生物素化蛋白固定在链霉亲和素包被96孔板上以应用于各类实验，避免自己包被铺板不均一的问题，且与非生物素体系相比检测速度更快、结合能力更强、非特异背景更低。
1. Seidah NG, Prat A, Pirillo A, Catapano AL, Norata GD. Novel strategies to target proprotein convertase subtilisin kexin 9: beyond monoclonal antibodies. Cardiovasc Res. 2019;115(3):510-8.
2. Ben-Naim L, Khalaila I, Papo N. Modifying pH-sensitive PCSK9/LDLR interactions as a strategy to enhance hepatic cell uptake of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C). Protein Eng Des Sel. 2022;35.
3. Brousseau ME, Clairmont KB, Spraggon G, Flyer AN, Golosov AA, Grosche P, et al. Identification of a PCSK9-LDLR disruptor peptide with in vivo function. Cell Chem Biol. 2022;29(2):249-58 e5.
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