ACROBiosystems百普赛斯Star Staining新一代定点标记技术平台开发的高质量荧光标记蛋白，可保持蛋白的天然构象，不影响蛋白活性，均一性好、批间一致性高。“星级”的研发实力，“星级”的技术平台及产品，Star Staining专为CAR-T细胞质控和临床样本分析检测而设计。
（文末福利，限时申领免费试用装哦~）
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫治疗是一种新型的细胞免疫疗法，其主要通过基因编辑技术使T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)从而特异性识别并杀伤表达相应抗原的靶细胞进而治疗疾病[1]。CAR的成功表达及靶抗原结合活性是CAR-T治疗成功的先决条件，荧光标记靶点蛋白因简单高效的流式检测流程及避免了因使用二抗而产生的非特异背景，成为CAR表达检测的关键原料，这对CAR-T细胞治疗药物的产品质控至关重要。然而高质量荧光标记蛋白的生产面临着诸多难题，如标记后蛋白活性难以维持、产品的批间一致性难以控制等问题，目前市场上少有高质量的荧光标记蛋白产品可供选择，实际上，这与荧光染料本身特性、以及使用的荧光标记技术密切相关。
目前，用于蛋白标记的荧光染料主要有小分子荧光（如荧光素类、罗丹明、Cy及Alexa系列等）及蛋白荧光（如藻红蛋白、藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白等）。
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）
FITC是应用最为广泛的一种荧光素（图1），经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光，最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大，常随着PH的降低而减弱，因此，在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。
图1 荧光素类标记试剂的主要结构(左)和FITC的分子结构(右)
从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙黄色荧光，最大发射波长为575 nm，PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点。在流式细胞术检测中，PE标记的蛋白适用于所有配备488/561nm氩离子激光器的流式细胞仪。
藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC）
从螺旋藻（一种蓝绿藻）中分离的藻胆蛋白，与其他藻胆蛋白一样，APC 是具有极高的吸收率和高量子效率的荧光物质。它是一种蛋白质，通过常规蛋白质交联技术可以很容易地与其他蛋白质连接，而不会改变其光谱特征。
罗丹明或香豆素的衍生物，是一种含有活性基团的有机荧光染料，主要有以下特点[2]：
水溶性好：通过亲水性磺酸基的引入，提高荧光染料的水溶性，且储存不易产生沉淀；
发射光谱窄：相较于传统有机荧光染料，Alexa Fluor染料具有较窄的发射光谱，从而降低多荧光检测的交叉串色。
抗淬灭、荧光强度强：光稳定性好，相关研究显示，将Alexa Fluor和AMCA、 Lucifer Yellow、荧光素、罗丹明6G和Cy3 等荧光标记蛋白的信号强度对比分析发现，尽管这些染料具有与Alexa Fluor染料类似的发射和激发光谱，但在各染料的吸收和发射光谱范围内Alexa Fluor染料量子产率更高、荧光强度更强、光稳定性更好（图2）[3]，尤其适用荧光成像的应用场景。
非pH敏感：PanchukVoloshina[3]等对Alexa Fluor染料的发射光谱、吸收光谱和荧光信号强度进行研究时，证明Alexa Fluor染料对pH的变化不敏感，可在 pH为4-10下保持稳定结构和强荧光信号。
图2 Alexa染料与其他荧光染料标记效果对比
接下来，一起来看几种常见的Alexa Fluor染料分子吧~
1）Alexa Fluor 488：Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致，经激光激发后发出绿色荧光，最大发射波长为519 nm，但其荧光强度和稳定性要优于FITC，且在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。
2）Alexa Fluor 555：Alexa Fluor 555的荧光光谱和Cy3非常接近，最大发射波长为565nm,荧光更强，稳定性更好，可耐受更长的荧光信号捕捉时间。
3）Alexa Fluor 647：Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料，其最大发射波长为668 nm，一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有荧光量子产率高、光稳定性好、pH耐受范围广和荧光不易淬灭等特点，是APC和Cy5的优质替代品。
传统的荧光标记蛋白，多采用非定点偶联的技术将荧光染料随机修饰到蛋白表面的特定基团，如琥珀酰亚胺（NHS）活化的染料与蛋白表面赖氨酸的侧链氨基反应或利用马来酰亚胺( Maleimide )活化的染料与还原后抗体表面的巯基形成共价键。此类修饰方法虽可满足大多数的蛋白荧光标记，但由于不同蛋白质氨基酸序列长度及蛋白质表面赖氨酸或半胱氨酸数目的差异，同样的荧光标记工艺对不同靶点蛋白的活性影响甚至相同蛋白质的不同生产批次的影响程度也有着较大的差异；同时由于大多数荧光染料本身的疏水结构(如FITC染料)，蛋白表面的亲水氨基酸被过多的疏水性荧光染料覆盖，极大的改变活性蛋白质本身的亲水性，由此造成的蛋白质聚集问题及其在产品存储、运输环节的稳定性，成为蛋白质荧光标记生产企业无法回避的巨大难题；此外，非定点蛋白荧光标记技术对产品生产的条件要求严格，反应温度、反应时间及反应浓度的变化均可能导致产品性能的巨大差异，主要表现在蛋白质的荧光标记度，蛋白质聚集及由此带来的蛋白质活性差异，难以满足标记类产品高活性、高批间一致的质量要求。
蛋白质定点荧光标记技术，是将荧光染料选择性的修饰到蛋白质的特定位点。通过蛋白质融合表达或利用蛋白质本身的构象选择，将蛋白质修饰位点远离蛋白质活性中心，最大程度的降低对目标蛋白质结合活性的影响；将荧光染料选择性的修饰到蛋白质特定位点，同时可降低对蛋白质表面电性及亲水性的改变，有效降低由于染料疏水作用导致的蛋白质聚集，为荧光标记蛋白产品的存储和运输创造条件；此外，高效、生物正交的蛋白质定点标记技术，在提高产品批间一致性的同时，可有效降低细胞水平的荧光检测非特异问题，为靶点蛋白的精确检测和量化提供必要的技术保障。
蛋白质荧光染料因其检测灵敏度高及可视化的独特优势，日益广泛地应用于生物分析，蛋白质组的识别和各项生理标检测等领域，荧光标记靶点蛋白也已成为生物医药行业，如细胞治疗药物开发过程中的关键检测原料。因此，搭建通用性的蛋白质荧光定点偶联技术平台及开发不同荧光染料的定点标记技术，是满足当前市场对荧光标记类蛋白产品日益增长的质量要求和多样化需求的必经之路。
-
蛋白特定位点标记
-
标记位点远离活性中心，维持蛋白天然空间构象
-
高效生物正交反应，无非特异信号
-
产物均一性好、批间一致性高
点击图片查看更多Star Staining相关产品
>>>明星产品——Alexa Fluor 555-Labeled Human BCMA Protein, His Tag Star Staining（Cat. No. BCA-HA2H6)
Anti-BCMA CAR-293 cells were stained with Alexa Fluor 555-Labeled Human BCMA Protein (Cat. No. BCA-HA2H6) and negative control protein respectively, Alexa Fluor 555 signal was used to evaluate the binding activity.
>>>明星产品——PE-Labeled Human Siglec-2 / CD22 Protein, His Tag Star Staining（Cat. No. SI2-HP2H5）
5e5 of anti-CD22 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) PE-Labeled Human Siglec-2, His Tag (Cat. No. SI2-HP2H5) and negative control protein respectively (Fig. C and B), and non-transfected 293 cells were used as a control (Fig. A). PE signal was used to evaluate the binding activity.
5e5 of PBMCs were stained with PE-Labeled Human Siglec-2, His Tag (Cat. No. SI2-HP2H5) and anti-CD3 antibody, washed and then analyzed with FACS. FITC signal was used to evaluate the expression of CD3+ T cells in PBMCs, and PE signal was used to evaluate the non-specific binding activity to PBMCs.
>>>明星产品——APC-Labeled Human CD19 Protein, His Tag star staining（Cat. No. CD9-HA2H9）
Anti-CD19 CAR-293 cells were stained with APC-Labeled Human CD19 (20-291) Protein (Cat. No. CD9-HA2H9) and negative control protein respectively, APC signal was used to evaluate the binding activity.
不同荧光标记产品的不同批次蛋白活性可保持一致，具有高批间一致性，以确保长期用于CAR-T细胞质控和临床样本分析中检测结果的稳定性和可靠性。
Binding activity of different lots of FITC-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HF2H3), AF555-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HA2H6) and PE-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HP2H7) against anti-BCMA CAR-293 cells was evaluated by flow cytometry. The result shows very high batch-to-batch consistency.
>>>高稳定性
25℃条件下加速48h和反复冻融三次，依然可保持较高的生物活性，显示出蛋白的高度稳定性，可放心储存和使用。
参考文献
[1] Yonghong Li, Yan Huo, Lei Yu, Junzhi Wang, Quality Control and Nonclinical Research on CAR-T Cell Products: General Principles and Key Issues.https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.12.003.
[2] 王洪苏, 关桂静, 刘金香. Alexa Fluor荧光标记在细胞学和分子生物学研究中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(9):71-71.
[3] Panchuk-Voloshina N, Haugland RP, Bishop-Stewart J, et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 1999;47(9):1179-1188. doi:10.1177/002215549904700910
[4] Dean KM, Palmer AE. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nat Chem Biol. 2014;10(7):512-523. doi:10.1038/nchembio.1556
Star Ribbon预染蛋白Marker蛋白质标记物是生物研究和药物开发的重要组成部分。无论是用于蛋白质电泳还是western blot，我们的预染色蛋白质标记物帮助您快速确定目标蛋白质的分子量或评估转移效率。Fc受体蛋白治疗性抗体的功效取决于Fab片段及其对目标抗原的结合活性，还取决于Fc片段及其与关键Fc受体的相互作用。因此，在抗体工程中候选物必须针对一系列受体进行测试。探索我们的重组Fc受体蛋白质的全面收藏！
膜杰作
Star Staining
