基因治疗中质粒DNA的质量控制

基因治疗是将外源基因导入人体以纠正基因缺陷的方法，通过转录和翻译实现对细胞基因表达的调控，从而合成特异性蛋白治疗相关疾病。质粒DNA（Plasmid DNA, pDNA）是自然存在于细菌中的环状DNA分子。其结构简单、具有自主复制能力、可以携带治疗基因，这些特性使其非常适合作为基因工程的载体。经基因工程改造过的pDNA，经过大量生产和纯化后，可用作一些生产工艺的原料，例如生产腺相关病毒（AAV）和慢病毒载体、 mRNA 生产过程中的体外转录（IVT）反应及直接基因转移等。目前，已经被广泛用于基因治疗的研究中。

各载体类型的基因治疗药物临床试验分布

Hemgenix: 是一款基于AAV5载体的基因疗法，该药物搭载有凝血因子IX（FIX）基因变体FIX-Padua，通过静脉给药，给药后该基因可在肝脏中表达FIX 凝血因子，分泌后进入血液发挥凝血功能，从而达到治疗目的，该药于2022年11月获FDA批准上市。

Ad5-nCoV：中国首个获批的腺病毒载体新冠疫苗“克威莎”，在Ad5腺病毒缺陷型载体中插入了SARS-CoV-2病毒全长野生型S蛋白，疫苗进入体内后能够同时引起体液免疫和细胞免疫反应。

RP-L201：是一种针对严重白细胞黏附缺陷症I型（LAD-I）的基因治疗产品，该疗法由患者的造血干细胞组成，这些干细胞经过慢病毒载体的基因改造，含有ITGB2基因的功能拷贝，在去年的欧洲基因与细胞治疗学会上，表示具有良好的临床疗效和安全性。

高质量的质粒DNA是基因治疗生产中的关键组成部分，需求量很大，需要优化生产纯化工艺以满足治疗药物生产所需质量要求。大规模质粒DNA常在大肠杆菌（E. coli）中发酵生产，一般工艺流程为: 载体构建→种子库的建立→发酵→收集菌体→裂解细胞固液分离→澄清与浓缩→分离纯化→产品质量控制→分装。（见下图）

工业规模开发和生产质粒DNA载体的流程图

虽然已建立大规模符合药学规格的质粒 DNA 生产工艺，能满足临床需求，但在这些生产工艺中还存在一些难以克服的瓶颈，如: 载体构建、细胞裂解、细菌染色体 DNA 去除、细菌内毒素去除、生产过程中质量控制等。

特别是细菌染色体DNA去除。宿主DNA与质粒 DNA 具有相同的电荷，分子量的大小是它们唯一的不同之处。然而，分离过程中的剪切力使宿主 DNA 断裂成与质粒 DNA 相近大小的片段(～10 kb) ，使得整个分离纯化过程难度增加，可能会影响终产品的质量。同时，质量标准的制定直接关系到产品的质量控制，从产品杂质角度看，应在细菌内毒素、宿主菌蛋白质残留量、外源DNA残留量及残留RNA等方面严格控制。

综上，随着基因治疗的进一步发展，质粒DNA临床用量需求不断增加，对工业化生产提出了更高的要求: (1)质量分析对最高质量的基因药物制剂的控制; (2)获得高纯度质粒DNA需减少相关污染物如宿主DNA、细菌内毒素等。除此之外，还应改善质粒保存条件，减少质粒在保存时遭到的破坏; 改善质粒载体系统，研究高效、新型载体，如去除细菌复制序列、抗性标记等细菌序列，以提高临床用药的安全性。

为支持基因治疗药物的相关研发，ACROBiosystems百普赛斯基于定量PCR法，专门设计开发了针对E. coli质粒DNA表达系统的超灵敏resDNA定量检测试剂盒（货号：OPA-O002），能够专一快速的对中控样品或原液成品中resDNA进行准确定量。

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★ 高灵敏度：根据定量PCR方法开发，LLOD达到1 fg/µL；

★ 高一致性：在不同DNA片段大小范围内保持一致的性能；

★ 高特异性：与无关DNA无交叉反应，减少检测的假阳性；

★ 严格质控：GMP厂房生产，符合ISO13485/9001质量管理体系;

★ 验证完善：参考ICH Q2（R2）指导原则，可提供完善的验证报告。

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高灵敏度：LLOD达到1 fg/µL

High sensitivity and broad dynamic range using the E.coli resDNA Quantitative Kit (qPCR) (Cat. No. OPA-O002). (A) Typical analysis results obtained with Standard 1 (300 pg/μL) to 6 (3 fg/μL). (B) The standard curve of the 10-fold dilution series. PCR efficiency should be 90-110%.

高特异性：与无关DNA无交叉反应

Assay specificity. Standard curves generated using 10-fold serial dilution of E. coli genomic DNA (included in the kit).

高一致性：在不同DNA片段大小范围内保持一致的性能

Consistent quantitation across a broad range of fragment sizes. Standard curves were generated using a 10-fold serial dilution of gDNA and fragmented DNA. Fragmented DNA was generated by sonicating total E. coli genomic DNA (8min, 13min, 20min). Fragmentation of the DNA was confirmed by agarose gel analysis.

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参考文献: