【双载荷ADC】——突破界限，引领ADC差异化创新之路

为了避免ADC市场竞争的同质化问题，差异化成破局关键。提高ADC的载荷水平（DAR值）、增强有效载荷的稳定性以及强化旁观者效应都是重要方向。尽管ADC在实体和血液癌症中表现出成功，抗药性和肿瘤异质性仍然是临床失败的主要原因。肿瘤异质性导致肿瘤具有不同的药物敏感性，从而促进侵袭性生长、高复发率和低生存率。为了应对这些挑战，多数化疗方案采用了药物的组合。双载荷ADC作为联合方案具有前景，并成为创新方向之一。

双载荷ADC通过在一种抗体上偶联两种不同载荷或同一载荷的两种不同Linker，灵活调整DAR值，提高ADC活性，并降低耐药性发生率，实现耐药性克服和多机制协同的目标。这种创新策略可调整ADC的理化特性和毒性特征，扩展适应症范围，充分利用双载荷递送的优势。

双载荷ADC的构建主要依托于工程化的反应性半胱氨酸残基、链间二硫键重塑技术、非天然氨基酸介导的点击化学、酶辅助连接、糖型重塑和糖缀合等技术。下面将简要介绍一些文献报道中关于双载荷ADC及其类似物的构建方法。

半胱氨酸（Cysteine，Cys）的巯基基团（-SH）可以与含有马来酰亚胺基团（-Mal）的载荷偶联以实现对抗体的位点选择性修饰。目前，利用Cys构建ADC的方法主要包括工程化的反应性Cys残基和抗体自身链间二硫键重塑技术。工程化的反应性Cys首次出现在Genentech公司的ThioMab™技术中，通过还原-氧化-偶联三步反应构建DAR值为2的ADC药物(实际DAR值1.7~1.9)。该方法目前有较多公司在其基础上进行优化，例如Zymeworks，Byondis等。二硫键重塑技术主要是利用TCEP/DTT还原IgG的链间二硫键，暴露出可用于偶联反应的Cys-SH。

西雅图遗传学公司的研究人员采用双Cys多路载体（Dual Cysteine multiplexing carrier）引入了两个保护的半胱氨酸基团[Cys (SiPr)+Cys (Acm)]，并利用不同的去保护反应构建了双载荷ADC。同时，该载体还包含PEG24片段，可以实现高载药量（DAR: 8+8），而不引起ADC的聚集。活性分析显示，利用该方法构建的cAC10-(2+3)在小鼠异种移植模型（DEL-BVR细胞系）中表现出良好的抗肿瘤活性，同时可以通过添加互补载荷来克服肿瘤细胞耐药。

双载荷ADC的构建及其抗肿瘤活性评价

MedImmune Inc.利用支链Linker引入双载荷。Linker上的炔基和酮基用于偶联药物，炔基通过铜催化的叠氮-烷基环化反应（CuAAC）来容纳任何叠氮装饰的药物，酮基可以通过肟连接来容纳带氨基的药物。第一种载荷MMAE通过肟连接，第二种载荷PBD-SG3557通过CuAAC安装，二者通过CHT色谱法进行纯化。

利用支链Linker构建双载荷ADC

体外活性测定发现，构建的双载荷ADC与PBD单药ADC具有同等高效的抗肿瘤活性。

表达 Her2 的 MDA-MB-453 乳腺癌细胞系

除了同一Linker上偶联不同的载荷，还可以在抗体不同位点偶联不同载荷。2019年报道了一种通过工程化硒半胱氨酸（Sec）和半胱氨酸（Cys）残基偶联MMAF和DNA损伤剂PNU-159682 来构建双载荷ADC的方法。体外实验证明，这种双载荷ADC对HER2阳性细胞系显示出选择性和有效的细胞毒性。

利用Cys和Se-Cys构建双载荷ADC及其活性、机制的研究

除了对Cys进行修饰外，有研究人员开发了一种基因密码子扩增技术，利用非天然氨基酸（UAA）实现抗体的位点特异性偶联。通过正交氨酰-tRNA合成酶（aaRS）/ tRNA的正交对，引入UAA并与目标分子构建ADC，这种偶联方法可控且定量，生成的ADC具有均一的DAR值、高效、稳定且安全。然而，UAA可能会使抗体诱导免疫原性，其疏水性也会增加抗体聚集的风险。

利用糖基化位点进行位点选择性修饰也是目前ADC构建的常用方法。上海药物所黄蔚教授课题组开发了两种构建位点特异性ADC的策略。一种策略是利用endo-S2催化的一步糖工程合成糖基特异性ADC的化学酶法，另一种策略是通过配体导向的基于硫酯的酰基转移试剂的化学方法以无痕方式合成K248位点特异性ADC。课题组通过三种不同路线在糖基化位点（N297）和K248位点组装同质双载荷ADC。最终选择路线A进行双载荷ADC的制备，该ADC在稳定性和抗肿瘤活性方面表现出优异性能。这项研究提供了新途径用于构建具有位点特异性的ADC。>>点击查看更多抗体理化分析工具酶

双载荷ADC构建路线的优化

德克萨斯大学休斯顿健康科学中心的Kyoji Tsuchikama课题组通过点击化学方法成功构建了均一的双载荷ADC，DAR组合可灵活调整为2+2,4+2和2+4。

他们设计了含有azide和me-tetrazine的支链连接子，其中azide-二苯并环辛烯（DBCO）和me-tetrazine-反式环辛烯（TCO）分别形成点击化学对，它们之间的反应不会发生交叉偶联。点击化学对与PEG间隔物、GluValCit可裂解连接子、PABC和载荷（MMAE/MMAF）进行偶联。

体外毒性研究表明，双载荷ADC对于HER2低表达且对疏水性化疗药物耐药的乳腺癌JIMT-1细胞系仍具有良好的抗肿瘤活性。在具有HER2异质性/耐药性的异种移植乳腺肿瘤模型中，其展现出比单药ADC或两种ADC联合用药更强的抗肿瘤活性。

目前，一些企业已经开始发展双载荷ADC技术，从而提高药物的疗效和治疗范围。例如，启德医药利用位点特异性偶联技术iLDC/iGDC，将拓扑异构酶I抑制剂和免疫激动剂两种载荷与抗TROP-2 mAb结合。在临床前研究显示该药物展现出增强的肿瘤杀伤能力和延长的免疫记忆。美雅珂、信达生物和普方生物都引入了Synaffix的HydraSpace™技术，HydraSpace™可以改善ADC稳定性、增加有效载荷溶解度、提高偶联的效率和速度，同时可提高药物载量以及实现两种作用机制的ADC药物。

双载荷ADC及其类似物的构建通过利用两个反应位点分步构建或利用单一反应位点引入分支Linker，再通过点击化学组装细胞毒性药物。虽然双载荷ADC构建方法目前已经较为成熟，但仍需进一步研究和改进。