为支持HEK293相关细胞系病毒载体残留DNA质控研究，基于荧光定量PCR法，ACROBiosystems百普赛斯现推出resDetect™ HEK293T残留DNA检测试剂盒，能够专一、快速的对质控样品中的resDNA进行准确定量，可更好满足不同包装细胞系下应选择对应细胞系基因组作为参考标准品的需求，保证质控结果的可靠性。
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近些年，全球范围内细胞和基因治疗蓬勃发展，其具有广泛的治疗潜力，特别是针对那些由细胞免疫功能异常或基因缺陷引起的疾病等。在细胞和基因治疗相关研究中，病毒载体作为将基因导入靶细胞并使其进行表达的介质，如何高效地进行病毒工业化生产，并确保病毒载体的质量和安全性，是困扰病毒工业化生产的重要瓶颈之一。
目前常用的病毒载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒等。根据不同的研究需求，科学家们可以选择不同种类的病毒载体进行基因导入。以目前细胞免疫治疗中最火热的CAR-T/NK为例，主要集中为两类病毒载体：逆病毒载体和慢病毒载体。虽然病毒载体在科学研究上百花齐放，但是其工业化制备的过程基本包括以下三步：1）将目的基因构建进入骨架质粒；2）将包装质粒转染进入包装细胞；3）收集上清并纯化病毒载体。具体的病毒载体生产制备过程如下（图1）：
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● 慢病毒载体主要流程为：目的基因获取→构建质粒测序验证→转染HEK293T→扩大培养→收获病毒上清→纯化浓缩；
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● 逆转录病毒载体主要流程为：目的基因获取→构建质粒测序验证→病毒瞬时包装→筛选得到稳转HEK293T细胞系→扩大培养→收获病毒上清→纯化病毒；
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● 腺相关病毒/腺病毒载体主要流程为：构建穿梭质粒→穿梭质粒与腺病毒骨架同源重组→转染HEK293/Sf9细胞→扩大培养→收集病毒上清→纯化病毒载体。
图1. Workflow of Viral vector
HEK293细胞，人胚胎肾细胞293(Human Embryonic Kidney Cells 293），又名HEK-293细胞（HEK-293）、293细胞（293 cells），是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系。相关研究表明，293细胞的19号染色体插入了大约4.5kb的腺病毒DNA片段。293细胞的核型处于不正常状态，而且不同的293细胞核型极有可能不同。不过，293细胞的染色体数目通常是64条（正常人类的染色体数目是46条），其X染色体、17号染色体、21号染色体的拷贝数一般为3[1,2]。HEK293T是一种由HEK 293细胞系衍生的人类细胞系，表达SV40大T抗原的突变体（图2）。293T细胞系最初在斯坦福大学Michele Calos的实验室中制造，是一种稳定转染了编码SV40大T抗原温度敏感型突变体质粒的HEK293细胞，最初被称为293/tsA1609neo。[1] 其在文献中第一次被称为“293T”，是在被用于开发生产逆转录病毒颗粒的BOSC23细胞系时。科研人员对3个独立的293T分离株细胞系都已经进行了全基因组测序，它们彼此之间是相似的，不过和原来HEK293细胞系的基因组都已经有可检测的差别[3]。
在病毒载体生产环节中，不可避免的会使用携带了致瘤基因、病毒来源序列的HEK293/HEK293T细胞系进行生产，这些包装细胞的DNA最终可能会残留到病毒载体中。作为细胞和基因治疗的重要介质，《人用基因治疗制品总论》《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》《免疫细胞治疗产品要学研究与评价技术知道原则（试行）》等文件均对病毒载体的生产和质量控制进行了通用性的技术要求。
残留DNA的检测方法通常采用定量qPCR，此方法能够快速、准确地检测和定量残留DNA的浓度。定量qPCR方法首先需要选择参考标准品制作标准曲线，为保持与实验检测样品间的扩增效率的一致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。因此，利用定量qPCR方法对病毒载体中残留DNA进行质量研究/控制时，为了保证结果的可信度，需要考量HEK293与HEK293T在基因组上存在差别，根据不同的包装细胞系，选择对应的细胞系基因组作为参考标准品，合适的参考标准品的准确性才能保证残留DNA的准确性。
为支持HEK293相关细胞系病毒载体残留DNA质控研究，基于荧光定量PCR法，ACROBiosystems百普赛斯现推出resDetect™ HEK293T残留DNA检测试剂盒，能够专一、快速的对质控样品中的resDNA进行准确定量，可更好满足不同包装细胞系下应选择对应细胞系基因组作为参考标准品的需求，保证质控结果的可靠性。
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Linearity
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R2≥0.99，Eff%：90%~110%
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Assay range
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300pg/μL~30fg/μL
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LLOD
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15 fg/µL
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Accuracy
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70%~130%
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Repeatability
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CV＜20%
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Time
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58 minutes
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Assay tests
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100 tests
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Storage
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Store at-15~-30℃ for 12 months
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High sensitivity and broad dynamic range using the HEK293T resDNA Quantitation Kit. (A) Typical analysis results obtained with Standard 1 (300 pg/μL) to 5 (30 fg/μL). (B) The standard curve of the 10-fold dilution series. PCR efficiency should be 90-110%.
Assay specificity. Standard curves generated using 10-fold serial dilution of HEK293T genomic DNA (included in the kit) in the presence of CHO DNA and E. coli DNA.
✦ E. coli resDNA Quantitative Kit (qPCR)
✦ HEK293 resDNA Quantitation Kit (qPCR)
✦ resDNA Sample Preparation Kit (Magnetic Beads)
✦ E1A resDNA Quantitation Kit (qPCR)
✦ E1A & SV40LTA resDNA Quantitation Kit (qPCR)
参考文献
1.Louis N, Evelegh C, Graham FL. Cloning, and sequencing of the cellular-viral junctions from the human adenovirus type 5 transformed 293 cell line. Virology. July 1997, 233 (2): 423–9. PMID 9217065. doi:10.1006/viro.1997.8597.
2.ECACC Catalogue Entry for HEK 293. hpacultures.org.uk. ECACC. [2012-03-18].
3.Lin, Yao-Cheng; Boone, Morgane; Meuris, Leander; Lemmens, Irma; Van Roy, Nadine; Soete, Arne; Reumers, Joke; Moisse, Matthieu; Plaisance, Stéphane. Genome dynamics of the human embryonic kidney 293 lineage in response to cell biology manipulations. Nature Communications. 2014-09-03, 5: 4767 [2020-01-03]. ISSN 2041-1723. doi:10.1038/ncomms5767.
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