【疫苗专题解读一】RSV preF，结构性疫苗最具标志性的成果

• 作用：二硫键维持了蛋白质在空间构象上的稳定性，并且可能由此改变蛋白物理或化学性质上的稳定性。二硫键的刚性连接可以阻止蛋白质二级结构或三级结构进行运动。

• 应用：二硫键添加方法在早期的成功实践被用于稳定呼吸道合胞病毒融合蛋白RSV preF的融合前状态。之后这一方法在结构疫苗学中被广泛使用，如在人偏肺病毒（Human metapneumovirus，hMPV）和副流感病毒融合蛋白融合前构象引入二硫键，均可显著提高蛋白免疫原性与中和滴度。

• 作用：脯氨酸在氨基上成环，使其比其他的氨基酸缺少一个氨基氢，降低了脯氨酸在螺旋结构中同其他氨基酸形成氢键的能力，同时又并不影响其自身的碳链骨架参与螺旋结构。因此，脯氨酸替换可以用于阻碍螺旋结构的延长，维持蛋白质多聚体结构从而稳定融合前构象。

• 应用：脯氨酸阻止螺旋延伸的倾向最初是在对流感血凝素融合蛋白的构象研究中发现的。率先应用于人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）包膜蛋白三聚体结构增加稳定性，证实有效后广泛用于 RSV 等病毒蛋白多聚体的稳定研究。近年来流行的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）疫苗的研发中已经广泛使用，在其他冠状病毒研究中已发现有效的脯氨酸添加来稳定抗原结构。

• 作用：空腔一般是指蛋白质骨架或侧链基团均没有占据的空间位置，空腔的存在直接降低了蛋白质折叠构象的稳定性，即空腔体积越大，蛋白质越不稳定。因此，用空间结构较大的侧链氨基酸填充位于抗原疏水核心内的空腔可以提高其稳定性 。

• 应用：空腔填充对稳定性的影响最早是在蛋白质折叠的研究中发现的。在结构疫苗学中，空腔填充方法最早用来尝试稳定HIV包膜蛋白，在近年来也被用于 RSV融合蛋白、SARS-CoV -2刺突蛋白的稳定性设计。

研究数据显示，结构稳定的preF是产生高效主动免疫的关键因素，以preF接种成人诱导的中和抗体滴度能够增加10倍以上，而以RSV融合后融合糖蛋白（postfusion fusion glycoprotein，postF）免疫仅能产生约 2 倍的增加。基于preF设计的、以老年人或孕妇为目标人群的4款RSV疫苗都取得了很好的保护效果，包括Ad26.RSV.preF（表达preF的26型重组腺病毒）与RSV preF（preF 亚单位疫苗）混合疫苗（强生）、AS01E-佐剂的RSV preF亚单位疫苗（葛兰素史克）、无佐剂的RSV preF亚单位二价疫苗（辉瑞）、 表达preF的mRNA疫苗mRNA-1345（莫德纳）。

而未采用preF设计的多款疫苗虽然在Ⅰ期或Ⅱ期临床试验中取得了较好结果，但均因未达到临床试验终点，先后宣布不进入Ⅲ期临床试验或Ⅲ期临床试验失败，如Novavax公司的RSV 纳米颗粒疫苗、葛兰素史克公司ChAd155.RSV（FNM2-1）和Bavarian Nordic公司的MVA BN-RSV（FG2NM2-1）等。

DOI 10.3969/j.issn.1673-5390.2023.12.008

葛兰素史克和莫德纳的RSV疫苗抗原则均以DS-Cav1为基础。DS-Cav1是2013年中美科学家联合设计的pre-F抗原。葛兰素史克的疫苗，是基于DS-Cav1的序列基础，通过引入半胱氨酸残基稳定在其融合前构象，形成二硫键，从而稳定蛋白质的构象或寡聚状态；莫德纳则选择在DS-Cav1的基础上，增加两个位点突变，使得DS-Cav1三聚体的单体之间增加了额外的二硫键，让三聚体结构更稳定。

RSV疫苗及药物研发解决方案

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特异性

分别使用RSV A型Pre-F蛋白（Cat. No. RSF-V52H7）、Post-F蛋白（Cat. No. RSF-V52H6）和B型Pre-F蛋白（Cat. No. RSF-V52H8）、Post-F蛋白（Cat. No. RSF-V52H9）对试剂盒特异性进行验证。测试结果显示，RAS-A176可特异识别A、B型RSV Pre-F蛋白，不识别A、B型RSV Post-F蛋白。

稀释线性

将高浓度的标准品加入到不同的稀释基质中，计算不同稀释比例下的回收率，均在80-120%范围内。

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稳定性

Cut-off值

两个实验人员三天检测的 OD 值的2.1倍的平均值作为当日 Cut-off 值，3 天 Cut-off 平均值将作为最终报告的 Cut-off 值，经计算最终报告的Cut-off值为0.142。

精密度

经验证该项目的批内及批间精密度CV均≤15%，满足试剂盒申明的标准范围

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