新一代4-1BB激动剂的探索之路

用于癌症免疫治疗的4-1BB激动剂的临床开发已成为业界关注的焦点。在今年的ASCO上，也有6家PD-L1/4-1BB双抗披露临床数据。不久前，礼进生物公布了4-1BB新一代激动性抗体艾林奇拜单抗（Exlinkibart、LVGN6051）在免疫治疗中的新进展。该抗体能够选择性地结合FcγRIIB，在肿瘤微环境中局部强激活4-1BB。该抗体与派姆单抗的联合治疗方案已被证明具有良好的耐受性，并在对肿瘤免疫产生耐药性的患者中实现了持久的客观缓解。艾林奇拜单抗与派姆单抗联合治疗在耐药性非小细胞肺癌、黑色素瘤和胃肠道恶性肿瘤中的Ib期剂量扩展，以及与安罗替尼联合治疗难治性软组织肉瘤的Ib/II期试验的最新临床数据将于2024年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会上详细披露。

4-1BB是肿瘤坏死因子TNF受体家族的成员，主要在活化的T细胞上表达，并在NK细胞、DC细胞、巨噬细胞等许多非T细胞上表达。4-1BB可以通过与其配体4-1BB Ligand的结合，诱导激活这些细胞并增强它们对癌细胞的杀伤性。进入临床的第一代4-1BB激动性抗体，Utomilumab疗效有限；Urelumab尽管具有抗肿瘤疗效，但会导致严重的肝毒性。

研究表明，内在激动强度和Fc的组合决定了抗4-1BB激动剂抗体的抗肿瘤和肝毒性特性。所有FcγR都可以与抗4-1BB抗体发生交联以诱导4-1BB激活并影响ADCC功能活性。因此，平衡激动活性与FcγR相互作用的强度作为设计具有最佳治疗性能的 4-1BB单克隆抗体的重要策略。

除了Urelumab和Utomilumab，还有新一代4-1BB激动性抗体正在积极研发中。目前开发的多样化的第二代4-1BB激动剂致力于解决第一代激动剂的局限性。当前的研究聚焦于调节4-1BB抗体功能方面。

例如，Eutilex公司开发的人源化的IgG1抗体EU-101，目前进行I/II期临床试验。同样作为人源化IgG1抗体的AGEN2373和ADG206，则因其与FcγR亲和力的差异而各具特色。天演药业开发的ADG206经过Fc端优，可将肿瘤微环境条件下的激活与强化FcγR介导交联带来的高激动型活性相结合，从而提升单药与联合治疗的潜在效力。临床前数据表明，ADG206在多种肿瘤模型的单药治疗中具有良好的耐受性与稳定的抗肿瘤活性，激活抗体对CD137激动型活性和T细胞共刺激比Urelumab强4倍。AGEN2373专注于与CRD4结合，而不干扰4-1BBL的结合；HOT-1030则通过结合CRD1，实现4-1BB受体的超激动性交联，不依赖于FcγR的结合，这有望减少因FcγRIIB交联而引发的肝毒性。

另一类是依赖功能性FcγR交联的人源化IgG4抗体，包括ADG-106、ATOR-1017、PE0116和CTX-471。这些抗体在它们在表位识别和 4-1BBL 阻断特性方面展示了与Urelumab和Utomilumab不同的策略。ADG106、ATOR-1017和PE0116抗体直接阻断了4-1BB/4-1BBL的相互作用，而CTX-471则结合于4-1BB的CRD2和CRD3结构域，但不干扰其与配体4-1BBL的结合。还有通过Fc突变来增强与FcγRIIB结合并减少与内源 IgG 的竞争的策略，如LVGN6051和STA551，这些抗体在肿瘤微环境中高ATP浓度下展现出较弱的激动性结合能力。此外，这些抗体具有较弱的激动性结合能力，或仅在肿瘤微环境中的高ATP浓度下结合于4-1BB。

开发双、三特异性4-1BB激动剂是克服系统毒性并提高4-1BB免疫治疗的另一种策略。除了与4-1BB结合外，它们至少与一个其他靶点结合，第二个靶点大多是肿瘤细胞表面表达的靶点(HER2、PSMA、EGFRvIII、Claudin18.2、ROR1、Nectin-4、CD47、CD19、B7H4)、肿瘤间质和肿瘤浸润性淋巴结表面表达的靶点(FAP)、肿瘤细胞和抗原提呈细胞共同表达的靶点(PD-L1)或仅在免疫细胞上表达的靶点(CD40、OX40、CD3)。保留4-1BB的激活功能的同时通过各种方式增加对肿瘤的选择性，以减少强烈的4-1BB刺激可能引发的系统性细胞毒性。多特异性抗体的开发通常采用了Fc修饰的设计以减轻由FcγR交联引起的肝毒性。

Claus等人研发了一种双特异性蛋白，该蛋白通过三聚体4-1BBL与T细胞上的4-1BB结合，并与成纤维细胞活化蛋白α（FAP）或抗CD19结合。此外，该蛋白的Fc区域经过突变，以防止FcγR介导的交联。这种设计使得蛋白质能够精确定位到表达FAP的肿瘤部位，并通过三聚体4-1BBL为T细胞提供共刺激。

英国Crescendo Biologics研究团队在《Clinical Cancer Research》上发表了关于新型双特异性共刺激Humabody VH治疗剂CB307作用机制的研究。CB307能同时靶向PSMA、CD137和HSA，在PSMA高表达的肿瘤微环境中有效激活T细胞，展现强大的抗肿瘤活性，同时保持可接受的系统耐受性，从而克服早期代4-1BB激动药的治疗局限性。其较小的分子量和与HSA的结合改善了生物分布，与检查点抑制剂联合使用增强疗效。非临床研究表明CB307具有良好的毒理学特性，为PSMA+肿瘤患者提供了新的治疗希望。

关于4-1BB抗体功能调节的研究仍在持续深入。联合使用或者做成双特异/多特异性抗体是第二代4-1BB激动剂的两条路。如4-1BB激动剂和PD-1/PD-L1阻断抗体。虽然这些双特异性抗体提供一种新的免疫调节途径，但需进一步研究比较其疗效方面优于两种不同抗体的组合。这些研究将指导未来癌症免疫治疗的发展。

• • 交联作用研究细胞株

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The purity of Biotinylated Human 4-1BB, His,Avitag (Cat. No. 41B-H82E6) is more than 90% and the molecular weight of this protein is around 25-35 kDa verified by SEC-MALS.

Immobilized UreluMab, Human IgG4 at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human 4-1BB, His,Avitag (Cat. No. 41B-H82E6) with a linear range of 1-15 ng/mL (QC tested).

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Immobilized Utomilumab at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human 4-1BB, His,Avitag (Cat. No. 41B-H82E6) with a linear range of 0.5-8 ng/mL (Routinely tested).

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• • 与抗体的结合活性经SPR验证

Biotinylated Human 4-1BB Protein, His,Avitag (Cat. No. 41B-H82E6) captured on Biotin CAP-Series S sensor Chip can bind anti 4-1BB mAb with an affinity constant of 0.158 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested) .

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Flow Cytometry assay shows that Human 4-1BB, Fc Tag (Cat. No. 41B-H5258) can bind to 293T cells overexpressing Human 4-1BBL. The concentration of 4-1BB used is 0.1 μg/mL (Routinely tested).

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Response to Anti-human 4-1BB antibody (RLU).

The Human 4-1BB (Luc) HEK293 Reporter Cell was stimulated with serial dilutions of anti-human 4-1BB antibody. The EC50 was approximately 0.83 μg/mL.

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Response to Anti-human 4-1BB antibody (FOLD).

The Human 4-1BB (Luc) HEK293 Reporter Cell was stimulated with serial dilutions of Anti-human 4-1BB antibody. The max induction fold was approximately 98.

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Agonistic activity analysis of anti-human 4-1BB antibody.

This reporter cell was incubated with serial dilutions of antibodies in the presence of CHO or CHO/CD32b. Urelumab, a strong intrinsic agonistic antibody, can activate 4-1BB signaling independent of CD32b-mediated crosslinking. Utomilumab, a weak agonistic antibody, can activate 4-1BB signaling dependent on CD32b-mediated crosslinking.

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参考文献：

Singh, R., Kim, YH., Lee, SJ. et al. 4-1BB immunotherapy: advances and hurdles. Exp Mol Med 56, 32–39 (2024). https://doi.org/10.1038/s12276-023-01136-4