认识内毒素
内毒素是革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）外膜中的脂多糖（LPS），这是一种“热原“物质，能够引起恒温动物体温异常升高。内毒素主要组成包括核心寡糖链、O-特异性多糖侧链和脂质A，脂质A是内毒素的主要毒性成分，其毒性反应包括发热、血流动力学改变、弥漫性血管内凝血，严重可导致休克。当细菌细胞活跃生长或者在细胞死亡后细胞膜分解时，外膜中的基本LPS成分会被大量释放到周围环境中。内毒素具有分子极性，易于聚集和吸附，形成不均匀污染。更重要的是，内毒素耐热稳定，需极端条件（如180℃
3-4h干烤、250℃ 1-2h）或强酸、强碱、强氧化剂加热方能破坏其生物活性。
在注射药品（如化学药品、放射性药物、抗生素等）、注射用水、生物制品（如抗体药、蛋白药等）、细胞与基因治疗药物以及医疗器械（如透析液、植入式器械和介入式器械等）、组织培养基等产品生产过程中，存在大量内毒素污染的可能性。尤其在大肠杆菌表达系统中，蛋白纯化前需破壁释放蛋白，这会导致产生大量内毒素，内毒素的去除与检测也成为原核蛋白表达纯化环节中非常关键的步骤。在酵母、CHO细胞表达系统或非生物生产系统中，虽然生产系统本身不产生内毒素，但生产过程中的外源性污染仍可能导致内毒素污染。内毒素作为热原类杂质，一旦进入人体内，便有可能引发高强度的免疫原性等反应，引起较严重的安全性风险。因此对内毒素的污染进行准确的分析检测，使之控制在安全范围内，成为药品生产质控的重要关注点。
革兰氏阴性细菌有两层膜：内膜和外膜，外膜成分中包含内毒素（LPS）
法规要求下的内毒素控制
内毒素在各种注射药品、医疗器械等产品的生产过程中必须严格控制，这些产品包括人用和动物用的注射药品（如化学药品、生物制品、细胞与基因治疗药物、放射性药物、抗生素等）以及医疗器械（如透析液、植入式器械和介入式器械、组织培养基等）等，其终产品、中间产品及原辅材料均需严格监控内毒素含量，以确保产品质量和安全性。相关法规/指导原则有：《注射剂安全性检查法应用指导原则》、《嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T细胞）制剂制备质量管理规范》、《人用基因治疗制品总论202012》、《结合疫苗质量控制和临床研究技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》、《人用重组DNA蛋白制品总论》分别提到了在产品的研发及生产过程中需要对内毒素进行控制。
内毒素检测方法
内毒素对生物体具有显著的毒性，准确检测其含量对注射药品、医疗器械等的安全性评估至关重要。目前常用的内毒素检测方法主要包括家兔热原法、鲎试剂法以及重组C因子法等。家兔热原法是传统的内毒素检测标准方法，其灵敏度较高，能够接近人体真实情况。家兔热原法可提供准确可靠的结果，但其操作繁琐且费时，不适合高通量检测。
随着生物学、物理化学、免疫学和遗传学的发展，鲎试剂法因其操作简便、高灵敏度和高重复性，逐渐取代了家兔法，成为各国药典的重要质量控制手段。鲎试剂提取自海洋节肢动物鲎的血液细胞，包含多种因子如C因子、B因子，其中C因子（丝氨酸蛋白酶前体）特异性地识别并结合细菌内毒素，可与微量内毒素发生反应并激活B因子，进而引发一系列酶促级联反应。然而，随着对鲎资源的需求增加和捕捞压力加大，这种基于鲎采血的生产方式正面临严峻挑战。特别是自2021年中国将鲎列为国家二级重点保护野生动物以来，可用于采血的鲎数量日益减少，这对鲎试剂的生产造成了重大影响。此外，不同批次、不同来源的鲎试剂可能存在敏感性和特异性的差异，这将直接影响内毒素检测结果的稳定性和准确性。
为了应对这些挑战，重组C因子（rFC）法作为鲎试剂法的替代方法应运而生，并逐渐受到关注。该方法利用基因重组技术表达重组C因子（Recombinant
Factor C,
rFC），rFC能够与内毒素结合并被激活，进而酶切水解底物产生荧光信号，荧光信号强度与内毒素的含量成正相关。重组C因子法仅利用鲎试剂的血凝级联反应第一步，避免了后续级联反应和G因子的干扰，从而使内毒素检测结果更加稳定和准确。此外，rFC法显著减少了对传统鲎试剂的需求，使得特殊品种细菌内毒素的检测更加精准。
更重要的是，多国药典对重组C因子法进行了规定和认可，允许使用重组试剂以适应特殊品种细菌内毒素的检测需求，减少鲎试剂的使用量。例如，2020版中国药典《9251细菌内毒素检查法应用指导原则》附录了重组C因子法，作为细菌内毒素检查法的补充方法；2024年7月26日美国药典（USP）微生物专家委员会批准将USP<86>Bacterial Endotoxins Test Using Recombinant Reagents纳入《美国药典-国家处方集》；2023年1月生效的欧洲药典（EP 11.0）章节2.6.32. Test for bacterial endotoxins using recombinant factor C明确了重组C因子检测细菌内毒素的方法和验证要求等。
鲎试剂法与重组C因子法检测流程对比
鲎试剂法与重组C因子法对比
内毒素检测解决方案
ACROBiosystems百普赛斯基于自主研发的内部平台，重磅推出基于终点荧光测定的重组C因子内毒素检测试剂盒（Cat. NO. RES-A056），该试剂盒采用C因子基因重组技术，可以快速、有效地检测样本中的细菌内毒素，确保检测结果的高灵敏度、高特异性、高批间一致性。试剂盒专为制药、医疗器械及生物制品等行业设计，旨在满足这些行业对内毒素检测的严格质量控制要求。
产品优势
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可与LAL方法相媲美：终点荧光测定法与LAL鲎试剂法相当。
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高特异性：消除了传统LAL法中β-1,3-葡聚糖等干扰因素，提高检测的特异性和准确性；
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准确性：试剂盒中内毒素标准品与USP标准品（货号：1235503）和中国细菌内毒素工作标准品（编号：150601）进行严格对标，具有可追溯性；
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简便快捷：1小时内快速完成检测；
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高灵敏度：检测范围为0.005-5 EU/mL；
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严格的方法学验证：全方位验证了试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、准确度、适用性等性能；
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不依赖于动物源性成分：降低了对鲎资源的依赖和捕捞压力，可实现长期稳定供货；
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卓越的缓冲液兼容性：可兼容于多种缓冲体系；
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良好的批间一致性：采用基因重组技术生产，产品批间一致性得到保证。
验证数据
Take
the logarithm of the concentration of the Endotoxin working standard
solution as the abscissa, take the ΔRFU as the ordinate. Fitting the
standard curve with linearly model, and the correlation coefficient R
should be ≥ 0.98.
Different
methods were used to detect endotoxin residues in five samples, and the
deviation between the detection results of rFC method and LAL method is
within 2 times.
The
kit is applicable in endotoxin detection of injectable drugs and some
medium, such as Recombinant Human Interferon α-1b, Human insulin
injection and different mediums. The results of the rFc method of this
kit are compared with those of LAL method.
The
rFC method was employed to detect endotoxin residues in β-glucan at
concentrations of 10ug/mL and 1ug/mL. No non-specific signals were
detected. In contrast, the dynamic chromogenic method used for β-glucan
detection resulted in the detection of endotoxin and non-specific
signals. This indicates that recombinant factor C does not react with
β-glucan, demonstrating the good specificity of the rFC method.
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参考文献：
1.Lipopolysaccharide-Binding Protein (LBP) as an Indicator of Disease States in Multiple Species
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