预制前体纤维（PFFs）在神经退行性疾病中的应用

阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是由异常蛋白质聚集引起的神经退行性疾病。在AD中，Tau蛋白过度磷酸化，导致其微管结合功能受损并形成神经纤维缠结，最终导致神经元死亡；在PD中，α-突触核蛋白（α-syn）聚集形成路易小体，沉积于黑质-纹状体通路的多巴胺能神经元中，破坏神经功能并影响突触传递。这些错误折叠的蛋白质具有“类朊病毒”传播特性，会作为模板诱导正常蛋白质错误折叠并在大脑中扩散，逐渐引发神经功能障碍。

为了深入研究这些蛋白质聚集及传播的机制，研究者们开发了预制前体纤维（Pre-formed Fibrils, PFFs）。在AD和PD的研究中，Tau PFFs和α-syn PFFs被广泛应用于细胞和动物模型中。这些PFFs通过诱导蛋白质聚集，模拟疾病进程，为研究聚集机制和筛选治疗药物提供了重要工具。

https://doi.org/10.3389/fnins.2017.00064

图1. 蛋白错误折叠和聚集示意图

为了制备Tau和α-syn PFFs，我们首先将自研的Tau和α-syn单体蛋白溶液浓缩至2-5 mg/mL，并在37°C下振荡孵育七天，以诱导PFFs的形成。随后，使用透射电子显微镜（TEM）观察野生型和突变型Tau PFFs及α-syn PFFs的形态特征。负染TEM结果显示，无论是野生型还是突变型的Tau PFFs和α-syn PFFs，均呈现出直径在100至500 nm之间的纤维结构，大多数纤维呈直线状，偶尔出现扭曲。以上结果表明，我们的PFFs产品为聚集体。

图2. Tau PFFs和α-syn PFFs的TEM图像

(A) Tau-441/2N4R PFFs（Cat. No. TAU-H5115）；(B) Tau-441 K18 (P301L) PFFs（Cat. No. TAU-H5113）；(C) α-syn PFFs（Cat. No. ALN-H5115）；(D) α-syn (A53T) PFFs（Cat. No. ALN-H5114）；标尺200nm。

为了验证PFFs的招募活性，我们进行了硫黄素T（ThT）检测。ThT是一种荧光染料，可以与富含β折叠的结构结合并增强荧光强度。在Tau的ThT测定中（图3A），Tau单体（蓝色曲线）聚集较慢，荧光在25小时后才开始上升；加入Tau PFFs（红色曲线）后显著加速了聚集，缩短了滞后期并增强了荧光强度；单独的Tau PFFs（橙色曲线）荧光无显著变化。在α-syn的ThT测定中（图3B），较高浓度的α-syn PFFs（紫色曲线）比较低浓度的α-syn PFFs（绿色曲线）更快地加速了单体聚集速度；α-syn单体（黄色曲线）聚集较慢。以上结果表明，我们的Tau PFFs和α-syn PFFs均可以显著加速单体的聚集过程。

图3. Tau PFFs和α-syn PFFs的ThT荧光检测

为了验证PFFs在细胞上的造模能力，我们开发了Tau-K18 (GFP)（Cat. No. CHEK-ATP087）和α-syn (GFP)（Cat. No. CHEK-ATP085）稳转细胞株。这些细胞在未暴露于外源性PFFs或长时间传代的情况下，较少情况下会自发形成包涵体。将PFFs转染至这些细胞后，通过共聚焦显微镜观察到细胞内出现核内斑点和核旁包涵体，验证了PFFs对蛋白聚集的诱导作用。

通过高内涵显微镜定量分析发现，使用Lipo2000介导PFFs转染可显著增强蛋白聚集效应；与野生型PFFs相比，突变型PFFs诱导会形成更多的包涵体（图4A），表明突变体具有更强的毒性。此外，对含有包涵体的细胞系进行多次传代后，包涵体和细胞毒性状态可以稳定存在，证明了Tau和α-syn聚集体具有稳定传播的特性（图4B）。

图4. PFFs诱导细胞模型中的蛋白质聚集

(A) 不同组别（α-syn PFFs、Tau PFFs、GFP对照组）蛋白聚集的定量分析。with：使用Lipo2000转染；without：未使用Lipo2000转染。(B) 经过两轮PFFs处理后，α-syn和Tau在细胞模型中的聚集形态。

利用脑类器官分化试剂盒（Cat. No. RIPO-BWM001K）分化的脑类器官，分别与不同浓度的Tau PFFs和α-syn PFFs共同孵育，构建神经退行性疾病模型。在AD模型中（图5），Tau PFFs的加入显著诱导了Tau的聚集，随着PFFs浓度的增加，Tau聚集程度加剧，表现为pTau181表达的上调（Cat. No. PT1-Y2073）（图5）。在PD模型中（图6），加入α-syn PFFs后，MAP2和TH的表达被破坏，表明成熟神经元（MAP2）和多巴胺能神经元（TH）受到了α-syn PFFs的损伤。

图5. Tau PFFs诱导脑类器官中的Tau聚集

图6. α-syn PFFs诱导脑类器官中的神经元损伤

在神经退行性疾病的研究中，ACROBiosystems百普赛斯高品质的PFFs产品为揭示蛋白质聚集与传播机制提供了强有力的工具。通过模拟Tau和α-syn蛋白的聚集，PFFs能有效促进细胞和类器官模型中疾病进程的研究，帮助科学家深入理解神经退行性疾病的早期机制，为药物筛选和开发提供宝贵的支持。

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参考文献

1.Rawat, P., Sehar, U., Bisht, J., Selman, A., Culberson, J., and Reddy, P.H. (2022). Phosphorylated Tau in Alzheimer's Disease and Other Tauopathies. Int J Mol Sci 23. 10.3390/ijms232112841.

2.Cookson, M.R. (2009). alpha-Synuclein and neuronal cell death. Mol Neurodegener 4, 9. 10.1186/1750-1326-4-9.

3.Jan, A., Gonçalves, N.P., Vaegter, C.B., Jensen, P.H., and Ferreira, N. (2021). The Prion-Like Spreading of Alpha-Synuclein in Parkinson's Disease: Update on Models and Hypotheses. Int J Mol Sci 22. 10.3390/ijms22158338.

4.Kaufman, S.K., Sanders, D.W., Thomas, T.L., Ruchinskas, A.J., Vaquer-Alicea, J., Sharma, A.M., Miller, T.M., and Diamond, M.I. (2016). Tau Prion Strains Dictate Patterns of Cell Pathology, Progression Rate, and Regional Vulnerability In Vivo. Neuron 92, 796-812. 10.1016/j.neuron.2016.09.055.

5.Sanders, D.W., Kaufman, S.K., DeVos, S.L., Sharma, A.M., Mirbaha, H., Li, A., Barker, S.J., Foley, A.C., Thorpe, J.R., Serpell, L.C., et al. (2014). Distinct tau prion strains propagate in cells and mice and define different tauopathies. Neuron 82, 1271-1288. 10.1016/j.neuron.2014.04.047.

6.Peng, C., Wei, W., Zhang, H., Wang, Y., Chang, B., Zhao, W., Jia, L., Li, L., Lu, F., and Liu, F. (2024). Heterologous expression and fibrillary characterization of the microtubule-binding domain of tau associated with tauopathies. Molecular Biology Reports 51, 184. 10.1007/s11033-024-09231-z.

7.Bachmann, S., Bell, M., Klimek, J., and Zempel, H. (2021). Differential Effects of the Six Human TAU Isoforms: Somatic Retention of 2N-TAU and Increased Microtubule Number Induced by 4R-TAU. Front Neurosci 15, 643115. 10.3389/fnins.2021.643115.

8.Elbaum-Garfinkle, S., Cobb, G., Compton, J.T., Li, X.-H., and Rhoades, E. (2014). Tau mutants bind tubulin heterodimers with enhanced affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences 111, 6311-6316. doi:10.1073/pnas.1315983111.

9.Röntgen, A., Toprakcioglu, Z., Tomkins, J.E., and Vendruscolo, M. (2024). Modulation of α-synuclein in vitro aggregation kinetics by its alternative splice isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A 121, e2313465121. 10.1073/pnas.2313465121.

10.Polymeropoulos, M.H., Lavedan, C., Leroy, E., Ide, S.E., Dehejia, A., Dutra, A., Pike, B., Root, H., Rubenstein, J., Boyer, R., et al. (1997). Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science 276, 2045-2047. 10.1126/science.276.5321.2045.